Enriquecimiento y caracterización de un óxido nítrico.

Mar 06, 2024

Nature Microbiology volumen 8, páginas 1574–1586 (2023)Cite este artículo

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El óxido nítrico (NO) es una molécula altamente reactiva y climáticamente activa y un intermediario clave en el ciclo microbiano del nitrógeno. A pesar de su papel en la evolución de la desnitrificación y la respiración aeróbica, su alto potencial redox y su capacidad para sostener el crecimiento microbiano, nuestra comprensión de los microorganismos reductores de NO sigue siendo limitada debido a la ausencia de cultivos microbianos reductores de NO obtenidos directamente del medio ambiente utilizando NO como sustrato. Aquí, utilizando un biorreactor continuo y un suministro constante de NO como único aceptor de electrones, enriquecimos y caracterizamos una comunidad microbiana dominada por dos microorganismos previamente desconocidos que crecen en concentraciones nanomolares de NO y sobreviven a altas cantidades (>6 µM) de este gas tóxico. , reduciéndolo a N2 con una producción pequeña o indetectable del óxido nitroso, gas de efecto invernadero. Estos resultados proporcionan información sobre la fisiología de los microorganismos reductores de NO, que tienen funciones fundamentales en el control de los gases climáticos activos, la eliminación de desechos y la evolución de la respiración de nitrato y oxígeno.

El óxido nítrico (NO) es una molécula fuertemente oxidante con funciones importantes en la biología celular y la química atmosférica. En la atmósfera, el NO contribuye a la contaminación del aire como precursor del potente gas de efecto invernadero óxido nitroso (N2O), a la producción de lluvia ácida y al agotamiento de la capa de ozono1,2. En biología celular, el NO se difunde fácilmente a través de las membranas celulares y reacciona rápidamente con otros radicales libres y con metales de transición3, lo que lo hace altamente tóxico para la vida microbiana4,5. Las propiedades fisicoquímicas del NO también lo convierten en una valiosa molécula de señalización6 y un intermediario clave en el recambio de especies de nitrógeno inorgánico7, lo que destaca que los microorganismos han desarrollado estrategias no solo para detectar y desintoxicar el NO, sino también para respirarlo de manera muy efectiva5,8,9.

De hecho, en la Tierra primitiva, mucho antes del inicio de la fotosíntesis oxigénica, el NO producido por los rayos y el vulcanismo era el oxidante más poderoso disponible para la vida (\({E}_{0}^{{{\prime} }}\) = +1,173 V (NO/N2O)) (\({E}_{0}^{{{\prime} }}\), potencial de punto medio estándar)10,11,12. En consecuencia, se plantea la hipótesis de que, antes del surgimiento de la respiración aeróbica, el NO jugó un papel clave en el impulso de la evolución de una vía bioenergética relacionada con la desnitrificación moderna12, en la que las ancestrales NO reductasas (NOR) sirvieron como precursoras de las oxidasas terminales utilizadas más tarde. en la respiración aeróbica13,14,15. Esto sugiere que una amplia diversidad de microorganismos capaces de recolectar energía a partir de la reducción de NO, independientemente de su toxicidad, deben haber evolucionado temprano en la historia de la vida en nuestro planeta.

En el ciclo moderno del nitrógeno, el NO es un intermediario clave en los dos únicos procesos que liberan N2 a la atmósfera: la oxidación anaeróbica del amonio (anammox) y la desnitrificación7. Durante el anammox, las bacterias del filo Planctomycetes reducen el nitrito (NO2-) a NO, que luego se utiliza para activar el amonio en hidracina en ausencia de oxígeno16. En la desnitrificación, el NO se transforma durante la reducción gradual de nitrato (NO3−) a N2 (NO3− → NO2− → NO → N2O → N2) por una gran diversidad de microorganismos que están muy extendidos en todo el árbol de la vida17. A diferencia de anammox, la desnitrificación puede completarse individualmente mediante microorganismos individuales o, alternativamente, mediante consorcios de diversos microorganismos, donde cada microorganismo lleva a cabo una o más de las distintas reacciones de reducción de N-óxido (ecuaciones (1) a (4)). . En línea con esto, se han aislado una variedad de microorganismos reductores de N-óxido utilizando NO3- y los intermedios de desnitrificación NO2- y N2O, pero no NO 18,19. Sin embargo, se ha demostrado el crecimiento microbiano directamente sobre este sustrato; por ejemplo, se demostró que las bacterias anammox crecen directamente sobre NO y amonio en ausencia de NO2- (ref. 8), y se sugirió que los microorganismos desnitrificantes aumentan su biomasa cuando se alimentan con NO en diferentes condiciones20,21,22. Aún así, la información sobre el crecimiento de microorganismos desnitrificantes en NO es escasa, y nuestro conocimiento sobre la fisiología de la reducción de NO, ya sea como una reacción independiente o como parte del proceso de desnitrificación, se basa en cultivos que no se obtuvieron usando NO y que normalmente son limitado a la inhibición y los efectos tóxicos del NO en las células5.

Aquí utilizamos con éxito NO como aceptor directo de electrones para el enriquecimiento de microorganismos reductores de NO en un biorreactor continuo. El cultivo de enriquecimiento, compuesto principalmente por dos miembros previamente desconocidos de la familia betaproteobacteriana Sterolibacteriaceae, 'Candidatus Nitricoxidivorans perseverans' y 'Candidatus Nitricoxidireducens bremensis', creció gracias a la reducción de NO a N2 y la oxidación de formiato, prácticamente sin acumulación de N2O. Se determinó la cinética de crecimiento microbiano del cultivo de enriquecimiento y su afinidad por diferentes N-óxidos. Paralelamente, utilizando metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica, se investigaron las reacciones bioquímicas que subyacen al crecimiento microbiano en el NO. Este estudio demuestra que los microorganismos prosperan y pueden enriquecerse con NO, y presenta oportunidades inexploradas para estudiar el recambio microbiano en esta molécula altamente energética y climáticamente activa que puede haber sido fundamental en la evolución de la desnitrificación y la respiración aeróbica.

Se inoculó un biorreactor continuo con biomasa de una planta de tratamiento de aguas residuales municipal (Bremen, Alemania) y se alimentó continuamente con NO y formiato como único aceptor y donante de electrones, respectivamente. El biorreactor se roció constantemente con Ar/CO2 para establecer condiciones anóxicas y evitar la conversión química de NO con oxígeno8,23. Durante 1.549 días, se enriqueció un cultivo reductor de NO mientras se convertía NO en N2 y se oxidaba el formiato en CO2 (ecuación (5)). La actividad y el crecimiento del cultivo se controlaron midiendo las concentraciones de NO, N2O, formiato y contenido de proteína total en el afluente y el efluente (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria). \(\Delta {G}^{0{\prime} }\), cambio de energía libre de Gibbs en condiciones biológicas estándar.

Los valores de N2O solo se muestran cuando la concentración medida estuvo por encima del límite de detección (10–25 ppm). El formiato se suministró como agente reductor para la conservación de energía y fuente de carbono para el crecimiento de la biomasa.

Datos fuente

Las células en el enriquecimiento eran predominantemente de vida libre y primero se retuvieron en el biorreactor usando un filtro de membrana. Después de 331 días, el cultivo presentó un consumo constante de sustrato (Fig. 1) y se retiró la membrana. Luego, las células se lavaron a una tasa de dilución de ~0,104 por día, lo que corresponde a un tiempo de duplicación de 6,65 días. El NO se redujo a una tasa de 1,69 (±0,1; n = 248) mmol por día (20,93 ± 5,1 µmol por mg de proteína por día; n = 175) y el formiato se consumió a una tasa de 2,38 (±0,2; n = 231 ) mmol por día (29,01 ± 6,3 µmol por mg de proteína por día; n = 165). Debido a que el NO se suministró en exceso con respecto al formiato, siempre permanecieron entre 700 y 1000 ppm de NO en el espacio de cabeza del biorreactor, lo que corresponde a 1,5 a 2,1 µM de NO disuelto (a 20,5 °C). El producto directo de la reducción de NO, N2O (ecuación (3)), fue indetectable (por debajo del límite de detección (10–25 ppm); n = 96) o solo se detectó en el espacio de cabeza en concentraciones bajas (39,58 ± 20,5 ppm; n = 128), lo que indica que como máximo ~2,8% del NO convertido podría detectarse como N2O e implica una rotación altamente eficiente de N2O a N2 (ecuación (4)). La actividad reductora de NO y N2O observada junto con el crecimiento continuo del cultivo indicaron que el cultivo de enriquecimiento creció mediante la reducción de NO a N2 junto con la oxidación del formiato.

Para determinar el rendimiento neto de biomasa, realizamos un experimento de 10 días en el biorreactor en el que se midieron el consumo de formiato, la reducción de NO y la producción de biomasa. Durante este período, el NO se redujo a 1,57 (±0,02; n = 6) mmol de NO por día y el formiato se consumió a 2,44 (±0,06; n = 6) mmol de formiato por día, que es casi idéntico a los índices observados durante la rutina. funcionamiento del biorreactor. La biomasa se produjo a una tasa de 0,48 (±0,02; n = 6) mmol C en la biomasa (C-mmol de biomasa) por día, lo que correspondió a un rendimiento neto de 0,20 (±0,01; n = 6) C-mmol de biomasa. por mmol de formato.

En general, durante el experimento de 10 días, la relación entre la reducción de NO y el consumo de formato fue de 1:1,56 (±0,02; n = 6). Según la estequiometría esperada de la reducción de NO acoplada a la oxidación de formiato (1:1; ecuación (5)), el 64 % del consumo de formiato podría estar relacionado con la reducción de NO, mientras que la asimilación de formiato en biomasa representó otro 20 %. El 16% restante del formiato consumido que no pudo vincularse con la reducción de NO ni con la asimilación de biomasa se explica tentativamente por la descomposición celular y la liberación de carbono orgánico disuelto, potencialmente en forma de intermediarios y desechos metabólicos.

Los coeficientes aparentes de media saturación (Km(app)), las tasas de reducción máxima (Vmax) y el coeficiente de inhibición del sustrato (Ki; solo para NO) del cultivo de enriquecimiento se determinaron para NO3-, NO2-, NO y N2O usando incubaciones por lotes ( Tabla 1 y figura complementaria 2).

En todos los experimentos, el cultivo de enriquecimiento estuvo inmediatamente activo tras la adición del sustrato. De los cuatro sustratos probados, la inhibición del sustrato solo se observó para NO, aunque con una Ki relativamente alta de 1,69 a 2,05 µM. El NO también fue el sustrato por el cual el cultivo de enriquecimiento mostró la mayor afinidad (Km (app) de 153–181 nM). Sin embargo, en comparación con la afinidad de los pocos microorganismos desnitrificantes estudiados por el NO (generalmente con valores de Km <10 nm)5,24,25,26, la afinidad del cultivo de enriquecimiento fue bastante baja, lo que estaba en línea con las condiciones de enriquecimiento de estos microorganismos con exceso de NO.

Los valores de afinidad del cultivo de enriquecimiento para NO3-, NO2- y N2O fueron similares entre sí y comparables a los reportados para microorganismos desnitrificantes y reductores de N-óxido26,27,28,29,30,31,32,33. La alta afinidad del enriquecimiento por N2O concordó con el eficiente recambio de N2O a N2 y su ausencia o acumulación transitoria en el biorreactor a concentraciones muy bajas.

Para investigar la composición de la comunidad y el potencial metabólico del cultivo de enriquecimiento reductor de NO, se extrajo y secuenció el ADN total en dos momentos diferentes (día 497 y día 1269; Tabla complementaria 1). Las lecturas metagenómicas se ensamblaron y agruparon en genomas ensamblados en metagenomas (MAG) que se anotaron y clasificaron taxonómicamente. A partir de la muestra metagenómica del día 1269, obtuvimos 12 MAG altamente completos (<3% de contaminación y>92% de integridad) de diversos filos bacterianos (Tabla 2 y Tabla complementaria 2) que representaron ~85% de la comunidad microbiana en el cultivo de enriquecimiento ( aproximado por la fracción de mapeo de lecturas metagenómicas). Cinco MAG contenían genes que codifican NOR y N2O reductasas (NOS), que son necesarios para reducir NO a N2 (ecuaciones (3) y (4)). Dos MAG codificaron solo NOS, lo que sugiere que estos organismos no utilizaron NO como aceptor de electrones y, en cambio, redujeron el N2O que podrían liberar otras células. Los cinco MAG restantes no contenían NOR ni NOS.

Los dos MAG con mayor abundancia relativa en el metagenoma, MAG1 y MAG5, correspondían a la familia Sterolibacteriaceae de las Betaproteobacterias y contenían los genes que codifican NOR y NOS. La taxonomía de estos dos MAG se investigó más a fondo combinando herramientas de clasificación de todo el genoma con análisis de identidad de ARN ribosomal (ARNr) 16S, identidad de nucleótidos promedio (ANI; Tabla complementaria 3) e identidad de aminoácidos promedio (AAI; Tabla complementaria 4) (detalles descrito en Información complementaria). Estos análisis indicaron que MAG1 y MAG5 correspondían a géneros previamente desconocidos dentro de la familia Sterolibacteriaceae (Fig. 2 y Fig. complementaria 3). Por lo tanto, MAG1 y MAG5 fueron denominados Ca. Nitricoxidivorans perseverans gen. nov., sp. noviembre y ca. Nitricoxidireducens bremensis gen. nov., sp. noviembre, respectivamente.

Genomas de representantes cultivados de la familia Sterolibacteriaceae y MAG de organismos no cultivados estrechamente relacionados con Ca. Nitricoxidivorans perseverans (MAG1) y Ca. Nitricoxidireducens bremensis (MAG5) se obtuvieron de GTDB y NCBI. Los organismos obtenidos en este estudio se indican en negrita. El género Thauera (GCF_001696715, GCF_002245655, GCF_001051995, GCF_000443165, GCF_001591165, GCF_000310205, GCF_003030465, GCF_001922305, GCF_00031018 5 y GCF_000310225) se utilizó como grupo externo. El árbol se calculó basándose en la máxima verosimilitud (1000 iteraciones) utilizando IQ-TREE. Los valores de arranque ultrarrápido96 superiores al 95% se indican en los nodos de rama. La barra de escala indica 0,1 sustituciones estimadas por sitio. El conjunto de genes marcadores bacterianos de copia única está según la ref. 76.

La abundancia de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis en el inóculo y el cultivo de enriquecimiento se determinó mediante deposición catalizada de reportero-hibridación in situ fluorescente (CARD-FISH) con sondas de oligonucleótidos separadas. Mientras que Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis representó menos del 1% de la población en la planta de tratamiento de aguas residuales (Figura 4 complementaria), en el cultivo de enriquecimiento, Ca. Nitricoxidireducens bremensis constituyó el 13,66% (±1,6%) de la población y Ca. Nitricoxidivorans perseverans se convirtió en la especie dominante con una abundancia relativa del 81,01% (±3,5%) (Fig. 3).

Se realizó doble CARD-FISH utilizando las sondas Nper205 y Nbre448 para apuntar a células de Ca. Nitricoxidivorans perseverans (verde) y Ca. Nitricoxidireducens bremensis (rosa), respectivamente, seguido de tinción DAPI de todas las células (azul). Los recuentos celulares se realizaron en piezas de filtro por triplicado a partir de recuentos CARD-FISH y DAPI (n ≥ 1000). Barra de escala, 10 µm.

Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la actividad reductora de NO y N2O del cultivo de enriquecimiento, los MAG de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Se exploraron Nitricoxidireducens bremensis, y el metatranscriptoma y el metaproteoma en busca de NOR y NOS y proteínas asociadas.

Para reducir el NO, tanto Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis utilizó una NO reductasa dependiente del citocromo c (Figuras complementarias 5 y 6) mientras codificaban y transcribían los genes catalíticos norC y norB y todos los genes accesorios (Tabla 3). NorB de ambos organismos y NorC de Ca. También se recuperaron Nitricoxidivorans perseverans del metaproteoma, junto con otras proteínas codificadas en el grupo de genes nor (Tabla 3 y Tablas complementarias 5 y 6). El producto directo de la reducción de NO, N2O, fue reducido por Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis utilizando clado II NOS (Figura complementaria 7), que a menudo tienen mayor afinidad por el N2O que clado I NOS, de acuerdo con las concentraciones mínimas de N2O detectadas en el biorreactor34,35,36,37. Curiosamente, ambos organismos codificaban copias duplicadas de genes nosZ que eran idénticos entre sí (es decir, excepto las copias de nosZ en Ca. Nitricoxidireducens bremensis que diferían en longitud en una lisina), lo cual, según nuestros análisis de la Base de datos de taxonomía del genoma (GTDB) y las bases de datos Genomes from Earth's Microbiomes (GEM), es una característica inusual de solo ~3,4% de los microorganismos que codifican NOS, lo que sugiere la importancia de la reducción de N2O en Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Todos los genes del grupo NOS se detectaron en el metatranscriptoma de ambos microorganismos (Tabla 3 y Tablas complementarias 5 y 6). Además, casi todas las proteínas NOS de Ca. Se detectó Nitricoxidivorans perseverans en el metaproteoma, mientras que solo la subunidad catalítica NosZ de Ca. Se pudo recuperar Nitricoxidireducens bremensis, probablemente debido a su abundancia mucho menor en el cultivo de enriquecimiento.

La actividad inmediata del cultivo de enriquecimiento durante los ensayos de afinidad de sustrato con NO3- y NO2- nos impulsó a explorar el metagenoma, el metatranscriptoma y el metaproteoma de las NO2- y NO3- reductasas codificadas por Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Ambos microorganismos contenían dos copias de la NO2-reductasa nirS del citocromo cd1 tipo cd1 y, mientras que Ca. Nitricoxidivorans perseverans portaba NO3-reductasas periplásmicas (napAB) y unidas a membrana (narGHI), Ca. Nitricoxidireducens bremensis codificaba sólo una NO3-reductasa periplásmica. Además, todos estos genes, junto con las chaperonas y transportadores necesarios, se detectaron en el metatranscriptoma y, con algunas excepciones, en el metaproteoma (Tabla 3 y Tablas complementarias 5 y 6).

Como el formiato fue el único donante de electrones suministrado al cultivo de enriquecimiento, se predijo que Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis acoplaría la reducción de NO a la oxidación de formiatos. En consecuencia, en el genoma del Ca se encontraron tres subunidades de la formiato deshidrogenasa (FDH) que contiene selenocisteína de tipo N u O. Nitricoxidireducens bremensis (OEL88_12710, OEL88_12715 y OEL88_12720) y en el metatranscriptoma y metaproteoma del cultivo de enriquecimiento (Tabla complementaria 6). Sorprendentemente, el genoma del microorganismo dominante, Ca. Nitricoxidivorans perseverans, no contenía ninguna FDH claramente identificable. Debido a que se predijo que su genoma estaría cerrado, según nuestros análisis, es poco probable que se hayan pasado por alto los FDH conocidos. En cambio, Ca. Nitricoxidivorans perseverans podría haber estado utilizando una FDH hasta ahora desconocida o una enzima con actividad oxidante de formiato desconocida y no convencional. Alternativamente, podría haber utilizado otros donantes de electrones que no fueron proporcionados externamente al cultivo de enriquecimiento pero que estuvieron disponibles como intermediarios metabólicos potencialmente liberados por otros microorganismos en el enriquecimiento.

Para asimilar directamente el formiato como única fuente de carbono, se requiere formiato-tetrahidrofolato ligasa (FTL) como primer paso de todas las vías de asimilación de formiato actualmente conocidas38. Aunque ~20% del formiato consumido por el cultivo de enriquecimiento se había atribuido a la asimilación de carbono, no se pudieron encontrar genes que codificaran FTL en los genomas de ninguno de los dos Ca. Nitricoxidivorans perseverans o Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Tampoco se encontraron otras enzimas implicadas en las reacciones de fijación de formiato, como la piruvato-formato-liasa, la lactato aldolasa y la 2-cetobutirato-formato-liasa38. Los microorganismos que consumen formiato a menudo utilizan únicamente formiato como fuente de energía y obtienen su carbono a través de la fijación de CO239,40; por lo tanto, es concebible que Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis utilizó el CO2 disponible en el biorreactor para la asimilación del carbono celular, mientras que otros microorganismos en el cultivo de enriquecimiento utilizaron formiato. De hecho, ambos organismos transcribieron todas las enzimas para el ciclo completo de Calvin-Benson-Bassham (CBB) (Tablas complementarias 5 y 6) con la excepción de la sedoheptulosa 1,7-bisfosfato aldolasa y la sedoheptulosa 1,7-bisfosfato fosfatasa, que faltaban en sus genomas pero cuyas funciones podrían ser realizadas por la fructosa 1,6-bisfosfato aldolasa y la fructosa 1,6-bisfosfato fosfatasa41,42,43,44. Todas las enzimas del ciclo de la broca correspondientes al Ca. También se detectaron Nitricoxidivorans perseverans en el metaproteoma, mientras que algunos de Ca. Faltaban Nitricoxidireducens bremensis.

En los microorganismos desnitrificantes, los electrones derivados de la oxidación de sustratos orgánicos o inorgánicos son transferidos a las diferentes N-óxido reductasas a través de una cadena de transporte de electrones45. California. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis poseía los genes de una NADH-quinona oxidorreductasa (complejo I), succinato deshidrogenasa (complejo II), varios citocromos de tipo C, dos citocromo c oxidasas hemo-cobre diferentes (incluido el tipo cbb3 de alta afinidad; complejo IV) y una ATPasa transportadora de H+/Na+ de tipo F (complejo V) (Tablas complementarias 5 y 6). California. Nitricoxidireducens bremensis también codifica un complejo de citocromo bc1 (complejo III), que en última instancia se utiliza para transferir los electrones a NIR, NOR y NOS. California. Nitricoxidivorans perseverans, sin embargo, no contenía los genes ni para el citocromo bc1 ni para sus alternativas, el citocromo b6f o el complejo alternativo III (ACIII)46. Nuestra hipótesis es Ca. Los nitricoxidivoranos perseverantes podrían evitar el complejo III por completo y utilizar un mecanismo diferente para transferir electrones del conjunto de quinonas a NOR y NOS, como se observa para otros microorganismos desnitrificantes47,48.

Además, Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis presentó vías metabólicas alternativas y potencial de quimiolitotrofía mediante la oxidación de hidrógeno y compuestos de azufre reducidos (Información complementaria y Tablas complementarias 5 y 6).

En este estudio, demostramos que el cultivo y enriquecimiento de microorganismos utilizando directamente NO exógeno como único aceptor de electrones es una estrategia exitosa para obtener microorganismos reductores de NO y estudiar su fisiología. El cultivo continuo usando exceso de NO y cantidades limitantes de formiato resultó en el enriquecimiento de dos especies previamente desconocidas que pertenecen a la familia Sterolibacteriaceae relativamente poco estudiada, con más del 81% de las células en el cultivo correspondientes a Ca. Nitricoxidivorans perseverans y ~14% a Ca. Nitricoxidireducens bremensis.

El cultivo de enriquecimiento convirtió NO en N2 casi sin acumulación del N2O intermedio y pudo consumir inmediatamente NO3- y NO2-, lo que indica que el cultivo tenía la capacidad de desnitrificación completa. Los análisis (meta)ómicos posteriores revelaron que tanto Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis utilizó NO reductasas dependientes del citocromo c (NorBC) y NosZ del clado II para reducir el NO a N2, y contaba con la maquinaria enzimática necesaria para llevar a cabo el proceso completo de desnitrificación. Además, estos organismos expresaron NO3- y NO2- reductasas en ausencia de estos sustratos, incluso cuando solo estaban presentes NO y N2O. Múltiples estudios han informado que la transcripción de NIR y NOR está coregulada49,50; sin embargo, la detección de la expresión de NO3-reductasa durante el crecimiento con NO, en ausencia de NO3-, es una observación rara e interesante47. En microorganismos modelo, se cree que las NO3-reductasas son inducidas por la presencia de NO3-, o por condiciones bajas de oxígeno en el caso de NAP51,52,53. Aún así, es concebible que el NO podría estar involucrado en la regulación de todas las proteínas reductoras de N-óxido en una diversidad de microorganismos hasta ahora no apreciada, lo que sugiere que la regulación de la reducción de N-óxido es más compleja de lo que se suponía anteriormente.

De los cuatro N-óxidos, el cultivo de enriquecimiento tuvo la mayor afinidad por el NO. Curiosamente, a concentraciones micromolares de NO que son tóxicas para otros microorganismos desnitrificantes54, la actividad reductora de NO del cultivo de enriquecimiento se inhibió solo parcialmente (~40% a 6,6 µM; Figura complementaria 2). Estas observaciones coincidieron con las condiciones de exceso de NO que estaban presentes en el biorreactor (1,5–2,1 µM) e indicaron que los microorganismos enriquecidos no solo podían crecer en concentraciones nanomolares de NO sino que también persistían en altas concentraciones de este gas tóxico y climáticamente activo. .

Si bien estaba claro que ambos microorganismos enriquecidos utilizaban NO y N2O como aceptores de electrones, desentrañar su estrategia para obtener equivalentes reductores y adquirir carbono celular no fue sencillo. Durante más de 1500 días de incubación, aproximadamente el 60 % del formiato se oxidó mediante el cultivo de enriquecimiento acoplado a la reducción de NO y N2O y aproximadamente el 20 % se fijó en la biomasa. Sin embargo, no se pudo encontrar una FDH en el microorganismo dominante Ca. Nitricoxidivorans perseverantes. Es posible que Ca. Nitricoxidireducens bremensis u otros microorganismos en el cultivo de enriquecimiento fijaron el formiato en compuestos de carbono más complejos, que se liberaron en el cultivo de enriquecimiento y posteriormente se oxidaron con Ca. Nitricoxidivorans perseverantes. Sin embargo, la dominancia de Ca. Nitricoxidivorans perseverans en el biorreactor sugiere que este microorganismo oxidó directamente el formiato utilizando una FDH aún desconocida o una proteína con actividad oxidante de formiato no caracterizada previamente, potencialmente otra proteína que contiene molibdopterina, como una de las NO3-reductasas altamente expresadas. Además, basándose en la ausencia de proteínas clave que se requieren en las vías conocidas de asimilación de formato38 de los MAG de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis, ninguno de los organismos utilizó formiato como fuente de carbono, sino que fijó CO2 a través de la vía de la broca. Es probable que Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis optimizó su actividad celular hacia la conservación de energía oxidando la mayoría de los donadores de electrones orgánicos disponibles, que están limitados en el cultivo de enriquecimiento, y utilizando CO2, que está en exceso, como fuente de carbono.

La investigación de sólo dos microorganismos enriquecidos con NO permitió conocer la respiración microbiana de este gas altamente reactivo y los mecanismos utilizados por estos organismos para regular sus cadenas respiratorias y adquirir carbono celular, algunos de los cuales no se ajustaban a lo que se ha revelado a través del estudio de organismos modelo, destacando las limitaciones de las predicciones metabólicas que se basan en análisis del genoma. Actualmente, se desconoce la contribución de los microorganismos que pueden crecer en una amplia gama de concentraciones de NO al ciclo del nitrógeno en entornos naturales y diseñados. Sin embargo, se puede especular que estos microorganismos podrían potencialmente alimentarse del NO y N2O liberados por otros microorganismos, eliminar el estrés nitrosativo y participar en la minimización de la emisión de estos gases climáticamente activos a la atmósfera. Estas propiedades también podrían ser clave para la posible aplicación de microorganismos reductores de NO y N2O en la eliminación biológica de NOx de corrientes de aguas y gases residuales. Con el tiempo, investigar las propiedades fisiológicas y bioquímicas de los microorganismos que respiran NO enriquecidos en diferentes entornos nos permitirá comprender mejor el control microbiano del recambio de NO y N2O.

Finalmente, el cultivo y enriquecimiento de aún más microorganismos que respiran NO, potencialmente convertidores de NO que carecen de una o más de las otras enzimas reductoras de N-óxido, o aquellos que codifican NO reductasas aún desconocidas, arrojarán más luz sobre la evolución. de las vías de respiración aeróbica y de N-óxido y de las enzimas involucradas en ellas, e incluso descubrir vías bioquímicas que permiten que los microorganismos crezcan utilizando la energía obtenida de las transformaciones de NO.

Se inoculó un biorreactor continuo (volumen de trabajo 2,4 l; Applikon Biotechnology) con biomasa (15% v/v) del tanque de eliminación de nitrógeno de la planta de tratamiento de aguas residuales municipal (hanseWasser Bremen). Inmediatamente después de la inoculación, se introdujo NO (10% N25 en He N46; Air Liquide) en el biorreactor como único aceptor de electrones a través de la fase gaseosa a un caudal de 0,3 ml min-1 diluido en Ar/CO2 (Ar 95% N50 , CO2 5% N55; Air Liquide) a un caudal de 19,7 ml min-1 para alcanzar una concentración de NO afluente de ~2200 ppm y mantener el biorreactor anóxico. El cultivo se agitó continuamente con dos turbinas estándar a 500 rpm. El biorreactor se mantuvo en una habitación con temperatura controlada a 20 ± 2 °C. El pH del cultivo se controló utilizando un electrodo de pH (Applikon Biotechnology) y se mantuvo automáticamente a ~7,3 con NaHCO3 1 M. El cultivo se suministró continuamente con medio mineral que contenía amonio 1 mM como fuente de nitrógeno y los siguientes nutrientes por litro: 150 mg CaCl2⋅2H2O, 100 mg MgSO4⋅7H2O, 50 mg KH2PO4, 0,5 ml de solución de Fe (10,32 g NTA y 4,72 g FeSO4⋅7H2O por litro) y 0,5 ml de solución de oligoelementos (30 g de NTA, 207 mg de MnCl2⋅ 4H2O, 115 mg de CoCl2⋅6H2O, 250 mg de ZnSO4⋅7H2O, 1,5 g de CuSO4, 36 mg de NaWO4⋅2H2O, 50 mg de NaMoO4⋅2H2O , 192 mg NiCl2⋅6H2O, 28 mg SeO2, 150 mg CeCl3 y 30 mg H3BO3 por litro). Se añadió formiato al medio afluente como único donante de electrones y se ajustó su concentración en el medio de acuerdo con su consumo en el cultivo. La concentración de formiato en el biorreactor siempre estuvo por debajo del límite de detección (<50 µm), con la excepción de cuando se crearon perturbaciones en el cultivo de enriquecimiento (por ejemplo, limpieza del biorreactor). Inicialmente, el medio se suministró a un caudal de 130 ml por día y la biomasa se retuvo en el biorreactor con un filtro de membrana hecho a medida (tamaño de poro de 0,2 µm). La concentración de formiato durante este período se incrementó gradualmente de 1 mM a 20 mM. El día 331, se retiró el filtro de membrana, el biorreactor se convirtió en un quimiostato y el caudal del medio se aumentó a 250 ml por día. Luego se ajustó la concentración de formiato en el medio afluente a 10 mM. Las únicas fuentes de carbono proporcionadas para la asimilación de carbono fueron el formiato, el bicarbonato en el tampón de pH y el CO2 en la mezcla de gases afluente. La actividad y el crecimiento del cultivo se monitorearon mediante muestreos dos veces por semana del cultivo líquido y del medio afluente para determinar las concentraciones de formiato y proteína, y de los gases afluentes y efluentes para medir las concentraciones de NO y N2O. Las muestras para mediciones de formato se centrifugaron durante 15 minutos a 21.000 gy los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C hasta el análisis. Las muestras para mediciones de proteínas se almacenaron directamente a -20 °C después del muestreo. Todos los cálculos de velocidad y gráficos relacionados con la actividad del cultivo de enriquecimiento en el biorreactor se realizaron utilizando MATLAB R2019a (MathWorks).

Las concentraciones de N2O en la corriente de gas efluente y, inicialmente, las concentraciones de NO en las corrientes de gas afluente y efluente se determinaron utilizando un sistema de cromatografía de gases 7890B equipado con una columna PoraPlot Q (Agilent Technologies) acoplada a un espectrómetro de masas cuadrupolo GAM 2000 con un electrón secundario. multiplicador (InProcess Instruments). A partir del día 269, las concentraciones de NO se determinaron mediante mediciones en línea utilizando un analizador de NOx nCLD 82 (Eco Physics) con un límite de detección de NO de 0,1 ppm. Las concentraciones de NO y N2O en el espacio de cabeza de las incubaciones por lotes utilizadas durante los ensayos de afinidad de NO y N2O se midieron inyectando muestras de gas en el analizador de NOx o en un sistema de cromatografía de gases 7890A (Agilent Technologies) equipado con una columna CP-PoraPlot Q y un micro. -detector de captura de electrones (μECD). Las concentraciones de formiato se determinaron mediante cromatografía iónica utilizando un 930 Compact IC flex equipado con una columna Metrosep A Supp 5–250/4.0 (Metrohm). Hasta el día 616, las concentraciones de proteínas en el cultivo de enriquecimiento se cuantificaron mediante un ensayo de proteínas (Bio-Rad), según las instrucciones del fabricante; después del día 616, se cuantificaron espectrofotométricamente las concentraciones de proteínas a partir de células lisadas (NaOH 1 mM, incubadas durante 10 minutos a 95 °C) utilizando el método BCA (Micro BCA Protein Assay Kit; Thermo Fisher). Las concentraciones de NO3- y NO2- en incubaciones por lotes utilizadas durante los ensayos de afinidad de NO3- y NO2- se midieron siguiendo un método de Griess adaptado55,56.

Las afinidades del cultivo de enriquecimiento por NO3-, NO2-, NO y N2O se determinaron mediante incubaciones por lotes. Para cada concentración inicial de cada sustrato, se iniciaron incubaciones por lotes duplicadas con 8 a 20 ml de biomasa recolectada del biorreactor. Se cerraron viales de suero de 20 ml, 40 ml o 60 ml con tapones de goma de butilo y cápsulas de aluminio y se lavaron con Ar/CO2 (95:5) para eliminar el aire. La biomasa no se lavó para evitar la pérdida de actividad y se añadió a los viales sin diluir o después de diluirla con medio mineral gastado esterilizado por filtración. Los viales inoculados se lavaron nuevamente con Ar/CO2 (95:5) y se estableció una sobrepresión de 200 mbar. El pH se ajustó a ~7,3 con NaHCO3 1 M anóxico. Se añadió formiato en exceso como donante de electrones para las reacciones de reducción. Se agregaron NO2- y NO3- a las incubaciones de reservas anóxicas para alcanzar la concentración inicial deseada (0,5 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM, 15 μM, 25 μM, 35 μM, 45 μM o 60 µM). Se inyectaron NO y N2O en el espacio de cabeza desde 10% NO (v/v, en He) y 100% N2O (N50; Air Liquide) para lograr las concentraciones disueltas deseadas (0,1 μM, 0,2 μM, 0,3 μM, 0,4 μM, 0,6 µM, 0,85 µM, 1 µM, 2 µM, 4 µM, 6,5 µM, 8 µM, 15 µM, 30 µM o 60 µM). Después de las adiciones de NO y N2O, los viales se incubaron durante 5 a 10 minutos para alcanzar el equilibrio del gas antes del primer muestreo. Todos los viales se incubaron a 20 ± 2 °C en una placa agitadora a 200–250 rpm. El consumo de sustrato se controló tomando muestras periódicas de 0,7 ml del líquido (para ensayos de NO2 y NO3) o de 0,1 a 0,25 ml del gas del espacio de cabeza (para ensayos de NO y N2O) durante un tiempo máximo de incubación de 2 h o hasta que el sustrato ya no se pudo detectar. Las muestras se retiraron de los viales después de lavar cuidadosamente las agujas y jeringas con Ar/CO2 para evitar la contaminación por oxígeno. El volumen extraído siempre se reemplazó con el volumen equivalente de Ar/CO2 (95:5). Las muestras líquidas recolectadas en cada momento durante los ensayos de NO3 y NO2 se filtraron inmediatamente a través de filtros de 0,22 µm y se almacenaron a 4 °C hasta su análisis. Las muestras de gas del espacio de cabeza se inyectaron directamente en el analizador de NOx o en el cromatógrafo de gases µECD para medir las concentraciones de NO o N2O, respectivamente. Una vez finalizada cada incubación, se recogieron y almacenaron muestras para la cuantificación de proteínas a -20 °C. Se monitorearon y registraron la presión total del gas en cada vial, el pH y la temperatura para garantizar condiciones reproducibles para todos los ensayos y para usarse en el cálculo de las solubilidades de NO y N2O.

Las concentraciones de NO3- y NO2- en cada muestra recolectada en diferentes momentos se utilizaron directamente para calcular las tasas de reducción de NO3- y NO2-. Las concentraciones disueltas de NO y N2O se derivaron de las constantes de solubilidad de la ley de Henry y las presiones parciales de los gases en el espacio superior de los viales. La concentración inicial de sustrato en los ensayos de afinidad de NO y N2O correspondió a su concentración acuosa, y las tasas de reducción del sustrato se calcularon utilizando la cantidad total de sustrato (es decir, concentraciones gaseosas y acuosas de NO o N2O en los viales). Las tasas de reducción del sustrato se normalizaron según la concentración de proteína en cada vial. Los datos experimentales se utilizaron para describir la cinética Monod de cada sustrato siguiendo el protocolo de ajuste de mínimos cuadrados no lineal descrito en otro lugar57. Como se observó una disminución en las tasas de reducción de NO a altas concentraciones de NO, se aplicó la ecuación de Haldane para determinar la constante de inhibición del sustrato para NO. Las medidas de bondad de ajuste y los intervalos de confianza del 95 % para las constantes cinéticas del sustrato utilizando los dos modelos se calcularon utilizando GraphPad Prism 9 (v.9.5.1.; software GraphPad) y se muestran en la Tabla complementaria 7.

Para determinar el rendimiento neto de biomasa del cultivo de enriquecimiento (que representa tanto el crecimiento como la descomposición celular), se midieron el consumo de formiato y la producción de biomasa en el biorreactor cada 48 h durante 10 días. Se recolectaron muestras líquidas del afluente y efluente por triplicado cada 48 h para mediciones de formato. Las muestras de efluente se centrifugaron durante 10 minutos a 4 °C y 21.000 g, y tanto los sobrenadantes de efluente como las muestras de afluente se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Se recogieron muestras por triplicado para la cuantificación de proteínas del efluente y se almacenaron a -20 ° C hasta el análisis. La composición elemental de la biomasa en el biorreactor se determinó utilizando un analizador elemental Vario Micro Cube (Elementar Analysensysteme) y se utilizó para calcular la concentración de carbono en la biomasa (C-mmol de biomasa). Cada 48 h, se recogieron 5 ml del cultivo de enriquecimiento por triplicado y se filtraron a través de filtros de microfibra de vidrio Whatman GF / F de 25 mm precombustidos (GE Healthcare Life Sciences) utilizando un vacío de 200 a 400 mbar. Las células se enjuagaron en los filtros dos o tres veces con tampón salino tamponado con fosfato. Los filtros se secaron durante 2 h a 60 °C, se incubaron durante la noche en una cámara desecadora con HCl 12,5 M y se secaron nuevamente a 60 °C. Luego se empaquetaron filtros completos en cápsulas de estaño y se midieron usando el analizador elemental. Se incluyeron filtros en blanco en el análisis para tener en cuenta el carbono y el nitrógeno de fondo. Se preparó una curva estándar con sulfanilamida (C6H8N2O2S) siguiendo el mismo procedimiento para calcular las cantidades de carbono en las muestras.

En los días 497, 1269 y 1304, se recogieron de 15 a 20 ml de biomasa y se sedimentaron mediante centrifugación durante 20 minutos a 4 ° C y 7942 g. El ADN genómico se extrajo de los sedimentos celulares utilizando el kit DNAeasy PowerWater (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se extrajo utilizando el kit RNAeasy PowerWater (Qiagen). Las concentraciones resultantes de ADN y ARN se determinaron con un fluorómetro Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific). La preparación y secuenciación de la biblioteca de ADN y ARN se realizó en el Max Planck-Genome-Centre Colonia (https://mpgc.mipz.mpg.de/home/) utilizando un instrumento Illumina HiSeq 3000 (Illumina) para generar extremos emparejados (2 × 150 pb) lecturas de muestras de ADN y ARN, y un sistema PacBio Sequel (Pacific Biosciences) con 1 célula SMRT para generar lecturas largas a partir de muestras de ADN. Las lecturas cortas obtenidas de la secuenciación de ADN con Illumina se recortaron con Trimmomatic 0.39 (ref. 58) y se ensamblaron utilizando SPAdes 3.15.3 con la opción -meta59. La agrupación de los contigs ensamblados se realizó con Maxbin 2.2.7 y Metabat 2.12.1, y se seleccionaron contenedores de alta calidad con DAS_Tool 1.1.1. Las lecturas largas obtenidas de PacBio se ensamblaron con Canu 1.9 (ref. 60) y Flye 2.9 (ref. 61). La integridad, la contaminación y la heterogeneidad de las cepas de cada contenedor se determinaron utilizando CheckM 1.1.2 (ref. 62). Las lecturas cortas de la secuenciación de ARN se recortaron con Trimmomatic y cualquier ARN ribosómico presente en el transcriptoma se eliminó utilizando SortMeRNA 4.1 (ref. 63). Los metagenomas se anotaron automáticamente con Prokka 1.14.5 (ref. 64), y se realizó un refinamiento manual de la anotación de genes seleccionados comparando la anotación de cada gen en el NR (GenBank 249; Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)), Bases de datos Pfam (35.0), UniProt (2022_1) y KEGG (101.0). Se buscaron proteínas de interés potencialmente involucradas en el metabolismo del formiato, pero que inicialmente faltaban en MAG1 o MAG5, alineando las secuencias de dichas proteínas con las presentes en miembros de la familia Sterolibacteriaceae usando MAFFT 7.407, creando perfiles para cada proteína usando hmmbuild (HMMER paquete 3.3.2) y compararlos usando hmmscan (paquete HMMER 3.3.2). Además, el complemento proteico de MAG1 y MAG5 se utilizó como consulta en una búsqueda RPS-BLAST en la base de datos de dominio conservado del NCBI para determinar aún más que no se pasara por alto ninguna proteína con actividad conocida de asimilación de formato. La presencia de genes que codifican FDH en MAG1 se investigó más a fondo buscando el complemento proteico de MAG1 en una base de datos de proteínas de molibdopterina personalizada con secuencias recuperadas de GTDB (versión 207) y GEM (versión 2021)65,66, y en comparación con genes no publicados recientemente. FDH canónicos67. La base de datos personalizada contenía todas las secuencias de proteínas de las subunidades de proteínas de unión a molibdeno de la superfamilia del complejo molibdoenzima hierro-azufre (CISM), incluidas todas las FDH conocidas68. Se identificaron cuatro proteínas, correspondientes a las subunidades grandes de diferentes molibdoenzimas: las proteínas OHM77_07745, OHM77_04925 y OHM77_12545, anotadas como NO3-reductasas periplásmicas y unidas a membrana (NapA y NarG) y sulfito deshidrogenasa (SoeA), respectivamente, que están bien miembros estudiados de la familia CISM; y la proteína OHM77_03730, anotada como una proteína hipotética, que no se parecía a ninguna FDH conocida u otra proteína de molibdopterina caracterizada. La abundancia del transcriptoma de los genes en MAG1 y MAG5 se determinó mapeando las lecturas en las secuencias de genes de cada MAG usando minimap2 (2.26)69 y posteriormente calculando los recuentos de lecturas por gen, con ambos pasos integrados en coverM (0.6.1; https https://github.com/wwood/CoverM). Luego, los recuentos de lectura se corrigieron según la longitud del gen y el número total de lecturas en el conjunto de datos del transcriptoma para obtener el RPKM.

Para investigar la frecuencia de múltiples copias de nosZ en los genomas de microorganismos desnitrificantes y reductores de N2O, se eliminó un conjunto de datos genómicos que consta de las especies representativas de GTDB y el conjunto 'GEM-OTU' de GEM al 95 % de ANI utilizando fastANI. (1.32)70. Se buscó el gen nosZ en el conjunto de datos final que contiene 78,768 genomas utilizando DIAMOND (2.0.15)71 con un enfoque de índice de puntuación BLAST como se describió anteriormente72. Se recuperaron un total de 6.004 genes nosZ en 5.799 genomas únicos, de los cuales 195 genomas (3,4%) contenían más de una copia del gen.

La ubicación taxonómica de los MAG recuperados se logró utilizando CheckM 1.1.2, GTDB-Tk 1.7.0 (ref. 73) y MiGA 1.1.2.2 (ref. 74). En el caso de MAG1 y MAG5, su afiliación taxonómica se complementó con filogenias del gen 16S rRNA y análisis de ANI y AAI promedio. Los ANI entre nuestros MAG y los representantes cultivados de la familia Sterolibacteriaceae se calcularon con FastANI 1.33 después del tratamiento con EMBOSS (6.5.0) para los genomas que comprenden más de un contig para obtener genomas concatenados. El AAI se calculó con el script aai.rb (ENVEOMICS 0.1.1)75 utilizando la secuencia de aminoácidos de las proteínas. Se construyó un árbol de genoma completo utilizando 120 secuencias de genes marcadores de copia única concatenadas76 de MAG obtenidas en este estudio que están relacionadas con la familia Sterolibacteriaceae (MAG1, MAG5, MAG2 y MAG6), dos MAG disponibles públicamente estrechamente relacionados con MAG1 y MAG5. y los genomas de miembros cultivados de la familia Sterolibacteriaceae disponibles en GTDB y NCBI. Para los cálculos del árbol filogenético del gen 16S rRNA, utilizamos las secuencias del gen 16S rRNA de los mismos MAG obtenidos en este estudio e incluidos en el árbol del genoma completo, aquellos de la familia Sterolibacteriaceae disponibles en la base de datos SILVA (SILVA SSU Ref NR 99 138.1) 77 y NCBI y, como grupo externo, seleccionamos secuencias del género Thauera de la familia Rhodocyclaceae.

Para calcular el árbol de HCO, se recuperaron secuencias de cada familia y las proteínas NOR presentes en miembros cultivados de la familia Sterolibacteriaceae usando blastp contra NR (GenBank 249; NCBI). Para los cálculos del árbol NosZ, utilizamos proteínas de los diferentes clados disponibles en el repositorio FunGene (7.3)78 y las proteínas NosZ presentes en los miembros cultivados de la familia Sterolibacteriaceae. Las alineaciones de secuencias se realizaron con MAFFT 7.407. Los árboles filogenéticos se calcularon en función de la máxima probabilidad (1000 iteraciones) con IQ-TREE 1.6.12 (ref. 79) con la opción –m MFP y se visualizaron usando iTOL (6.7.5.)80. La alineación de los sitios activos de HCO se realizó utilizando MAFFT 7.407 con un representante de cada familia de la superfamilia de HCO y las secuencias norB recuperadas de MAG1 y MAG5.

El día 1548, se recogieron 15 ml de biomasa, se sedimentaron mediante centrifugación a 7942 gy 4 °C durante 20 min y se almacenaron a -80 °C. Los pellets de biomasa se resuspendieron en 100 µl de agua milliQ y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos con agitación antes de la sonicación durante 10 minutos en un baño de sonicación (limpiador ultrasónico Branson 5800). Las muestras se centrifugaron a 14.000 g durante 20 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf como extractos "solubles" y se añadió RapiGest SF (Waters) hasta una concentración final de 0,1 % (v/v). Los pellets se lavaron con 100 µl de agua milliQ antes de agregar 50 µl de solución RapiGest SF al 2% (v/v) y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos. Las muestras se redujeron con una solución TCEP (Thermo Fisher Scientific) durante 20 minutos antes de la alquilación con cloroacetamida 50 mM durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La digestión enzimática se realizó incubando extractos de proteínas durante la noche a 37 °C con 0,4 µg de LysC (Wako Chemicals Europe) y 0,4 µg de tripsina (Promega). RapiGest SF se eliminó incubando digestos trípticos en ácido trifluoroacético al 0,5% a 37 °C durante 40 min y posterior centrifugación a 14.000 g durante 20 min a 4 °C. Las muestras se analizaron antes y después de la precipitación con disolventes orgánicos mediada por sales81.

Los digestos trípticos se midieron por duplicado mediante cromatografía líquida de nanoflujo (nanoElute; Bruker Daltonics) con espectrometría de movilidad iónica en línea-espectrometría de masas en tándem (timsTOF Pro 2; Bruker Daltonics) y tecnología de identificación de proteínas en tiempo real utilizando el motor de búsqueda de bases de datos paralelas en tiempo real. (PaSER 2023; Bruker Daltonics). Los péptidos se cargaron directamente en la columna analítica de fase inversa C18 (Bruker FIFTEEN 0,075 mm x 150 mm, partículas de 1,9 µm, tamaño de poro de 120 Å, C18 ReproSil AQ; Bruker Daltonics) a una presión constante de 800 bar y se separaron usando un 60- gradiente lineal de un minuto de duración de 3 a 45 % de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1 % con ácido trifluoroacético al 0,02 % a 500 nl min-1 a 45 °C. Los péptidos que eluyen de la columna se analizaron mediante fragmentación en serie de acumulación paralela en modo de adquisición dependiente de datos (dda-PASEF)82 utilizando el método predeterminado de ciclo de trabajo de 1,1 segundos (rango de masa, 100–1700 m/z; rango de movilidad, 0,6–1,6 1 /K0; tiempo de acumulación, 100 ms; tiempo de rampa, 100 ms; ciclos PASEF, 10; exclusión dinámica, 0,4 min). Los espectros de espectrometría de movilidad de iones adquiridos y espectrometría de masas en tándem se transmitieron directamente al cuadro PaSER para realizar búsquedas en la base de datos en tiempo real utilizando el motor de búsqueda ProLuCID (1.3)83. Se buscaron espectros de fragmentación en una base de datos de secuencias de proteínas personalizada construida con las secuencias de proteínas de MAG que tenían una abundancia relativa superior al 0,5% en la última muestra de metagenómica, correspondiente a MAG1 a MAG8, e incluyendo 28.576 proteínas. La búsqueda se limitó a las siguientes configuraciones: tolerancia de masa de precursor de 20 ppm, tolerancia de masa de ion de fragmento de 30 ppm, escisión tríptico estricta, máximo de 4 escisiones omitidas, carbamidometilo (C) como modificación fija y desamidación (NQ), oxidación (M). y formilación (K) como modificaciones variables. Los resultados de búsqueda individuales se combinaron y validaron utilizando DTASelect (2.0) con TIMScore habilitado para lograr una tasa de descubrimiento falso ≤1 % a nivel de proteína.

Una búsqueda en probeBase84 no reveló sondas previamente disponibles que se dirigieran a las secuencias del gen 16S rRNA de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Se diseñaron dos sondas de oligonucleótidos para apuntar a estos organismos utilizando las funciones de diseño de sonda y coincidencia de sonda del software ARB (6.1)85 y la base de datos SILVA SSU Ref NR 99 138.177,86. Las secuencias del gen 16S rRNA de longitud completa (>1500 pb) extraídas del metagenoma se importaron a la base de datos y se alinearon utilizando SINA (SILVA Incremental Aligner 1.2.12)87. La sonda S-*-Nper-0205-aA-23 (Nper205, 5′-TGTCGCGCGAGGTCGTTTCCAAT-3 ′) se dirigió solo a Ca. Nitricoxidivorans perseverans sin coincidencias erróneas y tuvo al menos una discrepancia con todas las demás secuencias en la base de datos y al menos cinco discrepancias con las otras secuencias de ARNr 16S extraídas del metagenoma. Se diseñó una sonda auxiliar (5′-ACTAGCTAATCCGGCATCGGCCGCT-3 ') para garantizar una hibridación eficiente de Nper205 con los organismos objetivo. Sonda S-*-Nbre-0448-aA-19 (Nbre448, 5′-TTAGGCGACGACCGTTTCGT-3′) dirigida sin discrepancias Ca. Nitricoxidireducens bremensis y otros cinco organismos no cultivados en la base de datos que no estaban presentes en nuestro cultivo de enriquecimiento y tenían al menos una discrepancia con todas las demás secuencias de la base de datos y al menos tres discrepancias con las otras secuencias de ARNr 16S extraídas del metagenoma. Las concentraciones óptimas de formamida para la hibridación de las sondas Nper205 y Nbre448 se determinaron a partir de perfiles de disociación de sondas88 generados con el software de análisis de imágenes daime89.

La biomasa recién recolectada del biorreactor el día 1256 y el lodo recolectado el mismo día y ubicación que el inóculo para el cultivo de enriquecimiento se fijaron con paraformaldehído al 2% como se describe en otra parte90. Las muestras fijadas se filtraron en filtros de policarbonato de 0,22 μm (Millipore) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

Para estimar la abundancia de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis en el cultivo de enriquecimiento y el lodo desnitrificante a partir del cual se inoculó, se realizó CARD-FISH en piezas de filtro con células del cultivo de enriquecimiento y el inóculo usando sondas Nper205 y Nbre448 como se describe en otra parte91. Las sondas Nper205 y Nbre448 requirieron concentraciones de formamida en el tampón de hibridación del 40 % y 30 % (v/v), respectivamente. Se incluyeron controles positivos y negativos con una mezcla equimolar de sondas EUB338-I, EUB338-II y EUB338-III92,93, y con sonda NON338 (ref. 94). Después de CARD-FISH, las células se tiñeron usando DAPI para apuntar al ADN de todos los microorganismos. Abundancias relativas de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis se determinó a partir de recuentos de CARD-FISH y DAPI (n ≥ 1000) en piezas de filtro por triplicado que se hibridaron con Nper205 o con Nbre488. Se realizó Double CARD-FISH para visualizar simultáneamente células de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis mediante hibridación con la sonda Nper205 seguida de inactivación de peroxidasas y un segundo paso de hibridación con la sonda Nbre448. Se utilizó el microscopio de epifluorescencia Zeiss Axio Imager M2 equipado con una cámara mono Axiocam 506 (Zeiss) para el recuento de células y la adquisición de imágenes.

California. Nitricoxidivorans (ni.tric.o.xi.di.vo'rans. NL neut. n. nitricum oxidum, NO; L. pres. part. vorans, comiendo; NL part. adj. nitricoxidivorans, comiendo NO, según su alimentación en ningún). La especie tipo del género es Ca. Nitricoxidivorans perseverantes.

California. Nitricoxidivorans perseverans (per.se've.rans. L. part. adj. perseverans, perseverante, en referencia a su presencia constante en el cultivo de enriquecimiento).

California. Nitricoxidireducens (ni.tric.o.xi.di.re.du'cens. NL neut. n. óxido nítrico, NO; L. v. reducir, reducir; NL masc. part. n. Nitricoxidireducens, reductor de NO). La especie tipo del género es Ca. Reducción de óxido nítrico de Bremen.

California. Nitricoxidireducens bremensis (bre.men'sis. ML masc. adj. bremensis, perteneciente a la ciudad alemana de Bremen, debido a su enriquecimiento desde una localidad de Bremen, Alemania).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar de los análisis metagenómicos y metatranscriptómicos y todos los MAG generados en este estudio se han depositado en el NCBI con el número de BioProyecto PRJNA849246. Los MAG de Ca. Nitricoxidivorans perseverans (MAG1) y Ca. Nitricoxidireducens bremensis (MAG5) se depositan, respectivamente, con los números de BioSample SAMN30388482 y SAMN30388483 y los números de acceso al genoma CP107246 y JAOTRT000000000. Los datos de metaproteómica, incluidos los archivos de datos sin procesar y los resultados de búsqueda de ProLuCID, se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través de la base de datos PRIDE95 con el identificador PXD037586. Las bases de datos utilizadas en este estudio son SILVA SSU Ref NR 99 138.1, NR (GenBank 249; NCBI), Pfam 35.0, UniProt versión 2022_01, KEGG versión 101.0, GTDB versión 207, GEM 2021 y FunGene 7.3. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a hanseWasser Bremen la oportunidad de probar la planta de tratamiento de aguas residuales en Seehausen; LH Orellana Retamal y B. Tschitschko por sus aportes en los análisis filogenéticos y taxonómicos; B. Schink y A. Oren por sus sugerencias sobre la denominación de Ca. Nitricoxidivorans perseverans y Ca. Nitricoxidireducens bremensis; K. Kitzinger por su ayuda con el diseño de sondas de nucleótidos; B. Vekeman por las discusiones científicas; y A. Wallenius, J. Köppen, D. Tienken y N. Böttcher por su asistencia técnica. PG-A., NS y BK recibieron el apoyo de una subvención inicial del Consejo Europeo de Investigación (640422) y de la Sociedad Max Planck. IG H. y DRS contaron con el apoyo de la Sociedad Max Planck. HJCTW recibió el apoyo de una subvención de inversión media de ZonMw (40-00506-98-9001).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Instituto Max Planck de Microbiología Marina, Bremen, Alemania

Paloma Garrido-Amador, Niek Stortenbeker, Daan R. Speth, Inmaculada Garcia-Heredia & Boran Kartal

Laboratorio Metabólico Traslacional, Departamento de Medicina de Laboratorio, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Hans JCT Wessels

Facultad de Ciencias, Universidad Constructora, Bremen, Alemania

Boran Kartal

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BK y PG-A. experimentos diseñados y analizados. PG-A. mantuvo cultivos, realizó experimentos de actividad y mediciones analíticas, y preparó material para metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica. NS mantuvo cultivos y realizó mediciones analíticas. IG-H., DRS y PG-A. Realizaron análisis metagenómicos y metatranscriptómicos. HJCTW realizó análisis metaproteómicos. Todos los autores discutieron los resultados. PG-A. y BK escribieron el artículo con aportaciones de todos los coautores.

Correspondencia a Boran Kartal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La Microbiología de la Naturaleza agradece a Magnus Ø. Arntzen, George Wells y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Información complementaria, figs. 1–7, Tablas 1–7 y Referencias.

Tasas de NO, formiato y N2O afluentes y efluentes en el biorreactor.

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Garrido-Amador, P., Stortenbeker, N., Wessels, HJCT et al. Enriquecimiento y caracterización de una comunidad microbiana reductora de óxido nítrico en un biorreactor continuo. Nat Microbiol 8, 1574-1586 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01425-8

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Recibido: 09 de febrero de 2023

Aceptado: 14 de junio de 2023

Publicado: 10 de julio de 2023

Fecha de emisión: agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01425-8

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