El impacto de factores abióticos seleccionados en el proceso de eclosión de Artemia a través de datos reales.

Dec 19, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6370 (2023) Citar este artículo

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Los estudios actuales sobre los impactos abióticos en la Artemia, un crustáceo ampliamente utilizado en acuicultura y ecotoxicología, a menudo se centran en análisis de puntos finales (p. ej., tasas de eclosión, supervivencia). Aquí, demostramos que se puede obtener una comprensión mecanicista mediante la medición del consumo de oxígeno en tiempo real durante un período prolongado en una plataforma de microfluidos. La plataforma permite un control de alto nivel del microambiente y la observación directa de los cambios morfológicos. A modo de demostración, se eligen la temperatura y la salinidad para representar parámetros abióticos críticos que también están amenazados por el cambio climático. El proceso de eclosión de Artemia consta de cuatro etapas diferentes: hidratación, diferenciación, emergencia y eclosión. Se ha demostrado que diferentes temperaturas (20, 35 y 30 °C) y salinidades (0, 25, 50 y 75 ppt) alteran significativamente la duración de las etapas de eclosión, las tasas metabólicas y la incubabilidad. Específicamente, la reanudación metabólica de los quistes de Artemia latentes mejoró significativamente a temperaturas más altas y salinidad moderada; sin embargo, el tiempo necesario para esta reanudación solo dependió de temperaturas más altas. La incubabilidad estuvo inversamente relacionada con la duración de la etapa de diferenciación de la eclosión, que persistió por más tiempo a temperaturas y salinidades más bajas. El enfoque actual de investigación del metabolismo y los cambios físicos correspondientes se puede emplear para estudiar los procesos de eclosión de otras especies acuáticas, incluso aquellas con una tasa metabólica baja.

La creciente concentración de gases de efecto invernadero causada por la actividad antropogénica está modificando el clima global y uno de los resultados inmediatos es una mayor temperatura ambiente1,2,3. Los océanos de todo el mundo, actuando como disipadores de calor, absorben la mayor parte de este calor4,5. La expansión térmica de los océanos como resultado del aumento del contenido de calor, así como el derretimiento de los glaciares, produce un aumento en el volumen del océano, lo que tiene un efecto directo sobre la salinidad del agua del océano6,7 que se ve exacerbado aún más por los cambios en el ciclo global del agua8,9 . Los efectos de las variaciones en estos parámetros sobre la reproducción y la salud pueden influir en la abundancia y distribución de diferentes especies acuáticas. Se han investigado los mecanismos de acción precisos de diferentes factores ambientales cambiantes, como los factores abióticos10,11 y los tóxicos ambientales12,13, sobre la respuesta fenotípica de diversas especies. Aquí, nuestro objetivo es obtener una comprensión mecanicista de los impactos de los cambios en el ambiente abiótico en el proceso de eclosión de Artemia, comúnmente conocida como artemia, a través del monitoreo en tiempo real. La artemia es un alimento vivo popular utilizado en la acuicultura debido a su alta densidad nutricional, facilidad de cultivo y tamaño relativamente pequeño, lo que hace que esta especie sea óptima para facilitar la alimentación de larvas marinas con boca pequeña14,15. También se utiliza ampliamente como organismo modelo en estudios bioquímicos, fisiológicos, genéticos, ecológicos y ecotoxicológicos16,17,18. A pesar de que Artemia vive en un ambiente hipersalino, que es su único mecanismo de defensa contra los depredadores19,20, la comprensión mecanicista de los efectos de los factores abióticos en el proceso de eclosión de Artemia puede potencialmente proporcionar información sobre los efectos de la alteración de la temperatura y la salinidad en el medio ambiente. eclosión de otros crustáceos muy extendidos en el medio marino, como los copépodos.

Las hembras de Artemia desarrollan un quiste de diapausa sin actividad metabólica detectable durante el modo de reproducción de oviparidad (diapausa endógena)21. En esta etapa latente, los quistes pueden deshidratarse mediante secado al aire o eliminación de agua osmótica, momento en el que los quistes están inactivos y pueden sobrevivir hasta 28 años22. El metabolismo de los quistes puede reanudarse (e iniciarse la eclosión) cuando las condiciones ambientales sean favorables23, siendo los principales parámetros ambientales abióticos que afectan la eclosión la temperatura y la salinidad del agua17,24,25. Varios estudios previos han investigado el impacto de estos parámetros ambientales abióticos en la eclosión de Artemia26,27,28,29,30,31; sin embargo, la evaluación se limitó a la medición de la tasa de eclosión al final del experimento. Por ejemplo, Kumar et al. observaron que el rendimiento óptimo de eclosión de Artemia se produjo a 29 °C y 29 partes por mil (ppt) de salinidad26, mientras que Sharahi et al. encontraron que las condiciones óptimas eran 27–28 °C y 35 ppt, respectivamente30. Hasan et al. mostraron que la proporción máxima de Artemia eclosionaba cuando la salinidad y la temperatura eran de 30 ppt y 24 °C, respectivamente, y que la tasa de eclosión disminuía a medida que la temperatura aumentaba de 24 a 32 °C mientras que la salinidad oscilaba entre 20 y 40 ppt27. Ahmed y cols. informaron que la salinidad óptima para la incubabilidad es 20 ppt31. En otro estudio realizado por Bahr et al. En cuanto a la influencia de la salinidad en la eclosión, la incubabilidad óptima se encontró con salinidades de 60 ppt y temperaturas alrededor de 30 °C28. La variación en los parámetros óptimos podría deberse a diferencias en los entornos de prueba (p. ej., exposición a la luz25,30,32) o variaciones en las condiciones ambientales (tamaño del contenedor, gradientes de temperatura/salinidad en medios a granel).

Este trabajo tiene como objetivo unificar las condiciones ambientales y ampliar la comprensión de los efectos de los parámetros abióticos más allá de la métrica final de la tasa de eclosión hasta un análisis mecanicista en profundidad de sus impactos en el proceso de eclosión de Artemia. Las cuatro etapas distintas de la eclosión de Artemia: (1) hidratación, (2) diferenciación, (3) emergencia y (4) eclosión33 se pueden diferenciar en función de los cambios morfológicos y el metabolismo34,35. En este estudio, hemos integrado un sensor óptico de oxígeno en un “acuario” de microfluidos para monitorear la tasa de consumo de oxígeno, también conocida como tasa metabólica de rutina36, en tiempo real durante todo el proceso de eclosión, mientras se emplea un microscopio óptico para capturar microfotografías de los quistes eclosionados a intervalos de tiempo regulares. Anteriormente se ha investigado el metabolismo de los quistes de Artemia37 y de otros pequeños crustáceos como Acartia tonsa38,39 y Leptodora kindti40 mediante el uso de diferentes técnicas de respirometría. El tamaño relativamente pequeño de la plataforma de microfluidos utilizada en este estudio puede disminuir la relación señal-ruido41,42,43 del sensor de oxígeno y permitir la correlación de los datos del sensor con los datos de imágenes del microscopio. La plataforma también puede mantener más fácilmente condiciones ambientales uniformes44,45,46 utilizando controladores programables fuera del chip en comparación con los sistemas a granel (como vasos de precipitados y peceras) utilizados en estudios contemporáneos. Recientemente, se han utilizado plataformas de laboratorio en un chip de microfluidos y milifluidos para aplicaciones farmacéuticas, incluidas pruebas de fármacos en células47, estudios biológicos en especies como C. elegans48,49,50,51,52 y pez cebra53,54,55. Además, en el presente trabajo, la precisión del análisis del punto final de la tasa de eclosión también se mejora mediante la transferencia automatizada (minimizando la contaminación y el error humano56,57,58,59) de toda la muestra analizada a un chip de conteo con tamiz. como estructuras de las que se pueden obtener imágenes en su totalidad y procesarse con análisis de imágenes en lugar de depender de una muestra por lotes y métodos de conteo manual.

Los quistes de artemia se compraron en Brine Shrimp Direct y se almacenaron a 4 °C según lo recomendado por el proveedor hasta un día antes de los estudios de eclosión, momento en el que se transfirieron a temperatura ambiente para permitir una adaptación gradual de la temperatura. La Figura 1A muestra las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) (JEOL FS-100) de los quistes de Artemia recibidos. Los quistes tienen una estructura en forma de copa y el diámetro de la estructura circular de la copa oscila entre 180 y 260 µm.

Configuración experimental. (A) La microscopía electrónica de barrido (SEM) muestra la estructura en forma de copa de los quistes de Artemia tal como se recibieron con un aumento de 450X. (B) Descripción esquemática de la plataforma de microfluidos para estudiar el efecto de los parámetros ambientales abióticos en el rendimiento de eclosión de Artemia. (C) Chip de eclosión con sensor de O2 integrado y sondas de temperatura conectadas (barra de escala = 5 mm) (La posición del punto del sensor de O2 se muestra en el recuadro) (D) Chip de conteo con estructuras tipo tamiz hechas de micropilares PDMS en la salida (escala barra = 10 mm) [Los quistes y nauplios atrapados en las estructuras de tamizado se muestran en el recuadro (barra de escala = 500 µm)].

Los estudios de eclosión de los quistes de Artemia se realizaron en una plataforma de microfluidos (Fig. 1B). La plataforma constaba de un chip para incubar, que tiene una cámara cilíndrica (diámetro de 13 mm, altura de 3,55 mm) conectada a una entrada y una salida (altura de 1,7 mm, ancho de 4 mm) (Figura complementaria 1A). El volumen total del chip para incubar es de ~ 563 µL. Se incorporaron esquinas redondeadas (filetes) en la entrada y salida para garantizar que los quistes no quedaran atrapados en las esquinas de la cámara durante la inserción al inicio de la eclosión y la transferencia de los quistes y nauplios al final del experimento. El volumen muerto se minimizó mediante la simulación del flujo de fluido en ANSYS FLUENT (Figura complementaria 1B). La Figura 1C muestra la cámara de eclosión utilizada para este estudio. El chip estaba compuesto de polidimetilsiloxano (PDMS) y se fabricó fundiendo PDMS en un molde (Figura 1C complementaria) preparado con una impresora 3D (MAX X-43, Asiga) y curado durante la noche a 60 °C en un horno de convección por gravedad (modelo : 10GC, Laboratorio Quincy). El chip para incubar tiene dos capas. La capa superior tiene las estructuras de cámara y canal, y la capa inferior es una losa de PDMS en blanco. Tanto la capa superior como la inferior del chip para incubar se unieron mediante tratamiento corona (BD-20AC, ETP) y calentamiento posterior a 60 °C durante la noche. Antes de unir las capas, se hicieron varios agujeros en la capa superior utilizando punzones de biopsia para la entrada, la salida y los sensores. Se unió un punto de sensor de O2 (OXSP5, Pyroscience) a la capa superior de PDMS dentro de la cámara utilizando pegamento de silicona (Spglue, Pyroscience). Se conectó una fibra óptica exactamente detrás del punto del sensor de O2 a través de un orificio en el chip PDMS. La fibra óptica se conectó a un medidor de oxígeno óptico externo (FireSting®-O2, Pyroscience). El medidor de oxígeno estaba compuesto por un diodo emisor de luz (LED) y un fotodiodo que estimulan y detectan la emisión de luminiscencia dependiente del oxígeno del punto sensible al oxígeno y miden la concentración de oxígeno disuelto del agua en la cámara cada segundo durante la eclosión. También se conectó una sonda de temperatura (Pt100, Pyroscience) al chip para detectar la temperatura del agua dentro del chip y así compensar las lecturas de concentración de oxígeno disuelto por cualquier fluctuación de temperatura. Para minimizar la variación, el chip se colocó encima de un calentador de película (calentador de película PI-24 V, Icstation) conectado a un controlador proporcional-integral-derivado (PID) (controlador de termostato electrónico de 6-30 V CC, DROK) que controlaba la temperatura del agua dentro del chip de incubación según la temperatura establecida (20, 25 y 30 °C). Se utilizó un adaptador de corriente CC de voltaje variable (ALP002, KEJIESHENG) para alimentar el controlador PID y se le conectó una sonda de termopar (TC 10K, QINGDAO) para medir la temperatura del agua dentro del chip. El controlador PID ajusta la potencia de entrada de acuerdo con la medición de la sonda para mantener una variación máxima de 0,1 °C con respecto a la temperatura establecida. El chip de eclosión con el calentador incorporado se colocó bajo un microscopio óptico estéreo digital (SE400-Z, Amscope) equipado con una cámara digital (MD500, Amscope) para capturar una fotomicrografía del chip cada cinco minutos durante la eclosión. Durante todo el proceso de eclosión, se mantuvo encendida continuamente una luz de diodo emisor de luz (LED) (1W, Amscope) debido a su efecto sobre la eclosión26,32.

Antes del inicio del experimento, el agua para la eclosión se preparó agregando cantidades variables de sal marina disponible comercialmente (Mar de Fluval, pH: 8,1–8,2) al agua desionizada (DIW) (preparada y filtrada (tamaño de poro del filtro = 200 nm). ) utilizando el sistema de purificación de agua Barnstead Smart2Pure, Thermo Scientific) para producir agua salada artificial con salinidades de 0, 25, 50 y 75 partes por mil (ppt) que se mezclaron en un tubo de ensayo utilizando un mezclador vórtex (Vortex genie 2, Scientific Industries) . La mezcla completa de la solución de agua salada permite una distribución uniforme del oxígeno y la sal disueltos. El peso de los quistes de Artemia se midió utilizando una balanza de precisión digital (Bonvoisin) y se mezcló cuidadosamente con la solución de agua salada para que la concentración del quiste fuera de 5 g/l. La solución del quiste se insertó inmediatamente dentro del chip de eclosión hasta que se llenó la cámara. Luego se cerró la entrada y salida del chip mediante tubos flexibles y clips de sujeción para evitar la infiltración de aire dentro del chip. Los experimentos de eclosión se realizaron durante 24 h desde el momento en que los quistes se sumergieron en las soluciones salinas. Los experimentos de eclosión se realizaron por triplicado para cada condición de temperatura (20, 25 y 30 °C) y salinidad (0, 25, 50 y 75 ppt).

Las diferentes etapas de eclosión de Artemia y la transición entre ellas se pueden identificar a través de cambios en el agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) del agua en el chip de eclosión cerrado como resultado del consumo de oxígeno por parte de los quistes, medido por el on- sensor de oxígeno en chip y las fotomicrografías tomadas por el microscopio óptico. Esto proporciona información sobre el consumo de oxígeno y la duración de las distintas etapas de la eclosión. Los resultados del consumo de oxígeno se normalizan teniendo en cuenta la tasa de concentración de oxígeno (ROC) en cada etapa porque el valor absoluto y la duración de las distintas etapas de la eclosión varían con la temperatura y la salinidad. La República de China también puede considerarse una tasa metabólica estándar como se menciona en la literatura36. La ROC se calculó utilizando la siguiente fórmula

En cada etapa de eclosión, se midió la duración y la ROC correspondiente, con excepción de ciertas temperaturas y salinidades, en las cuales las etapas de emergencia y eclosión no se completaron en el período de eclosión de 24 h (Ver “Efecto de la salinidad y temperatura del agua en la duración de las diferentes etapas de la eclosión”).

La profundidad del chip de eclosión (3,55 mm) se diseñó para garantizar que el fluido de suspensión tuviera suficiente oxígeno disuelto para la eclosión y espacio para que los nauplios naden. Esta profundidad permitió múltiples nauplios y quistes en el mismo plano vertical, lo que impidió un recuento preciso de nauplios y quistes. Por lo tanto, se diseñó un chip de recuento (Fig. 1D) con una cámara de poca profundidad (800 µm) de modo que los nauplios y quistes quedaran restringidos a una sola monocapa. El chip tenía una entrada y una salida. La salida contenía micropilares PDMS que actuaban como estructuras similares a un tamiz (inserto de la Fig. 1D) y permitían que solo el agua fluyera a través del canal, evitando que los nauplios y quistes en la cámara escaparan. El chip tenía dos capas: la capa superior tenía una cámara, estructuras de micropilares, entrada y salida y estaba construida con PDMS fundido en un molde impreso en 3D (Figura complementaria 2A). La capa inferior era una losa de PDMS en blanco. Ambas capas se unieron mediante tratamiento corona y calentamiento posterior, como se describió anteriormente. En la entrada y salida del chip de recuento, la altura es mayor que la de la cámara (1,7 mm frente a 800 µm) y está diseñada con un radio de filete de 900 µm para permitir un flujo suave de quistes y nauplios de Artemia a través de la entrada y salida. . La figura complementaria 2B muestra los resultados de una simulación ANSYS Fluent del flujo de fluido a través del chip, lo que demuestra la ausencia de volumen muerto. Después de 24 h, los nauplios eclosionados y los quistes eclosionados/no eclosionados en el chip de eclosión se transfirieron al chip de conteo automáticamente en una solución de metanol al 30 % a un caudal de 100 µl/min mediante una bomba de jeringa (Pico plus 11 elite, Harvard Apparatus). La salida del chip de eclosión y la entrada del chip de conteo se conectaron mediante un tubo de poli(tetrafluoroetileno) (PTFE), y la entrada del chip de eclosión está conectada a la jeringa montada en la bomba de jeringa a través de un tubo Tygon flexible. Los nauplios de Artemia nadan rápidamente después de la eclosión y se usó la solución de metanol al 30% en DIW para sacrificar los nauplios y obtener imágenes claras en el chip de conteo. Se utilizó una cámara digital (D3100, Nikon) para capturar imágenes de los nauplios y quistes presentes en el chip de eclosión. Las imágenes se procesaron en ImageJ, donde se contó el número de quistes y nauplios en función de su circularidad. Si algún objeto tenía una circularidad mayor o igual a 0,9, se consideraba un quiste (eclosionado o no eclosionado), y cualquier objeto en la imagen con una circularidad menor (menos de 0,9) se consideraba nauplio (Figura complementaria. 3). La tasa de eclosión se calculó utilizando la siguiente fórmula

Se utilizó OriginPro (ver. 2022b, OriginLab) para todos los análisis estadísticos. Los datos se representan como media ± desviación estándar. Como se mencionó anteriormente en “Tasa de consumo de oxígeno y duración de las diferentes etapas”, a determinadas temperaturas y salinidades, las etapas de emergencia y eclosión no se completaron en 24 h. Así, para estas etapas, la importancia de los datos se determinó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de una prueba post-hoc de Bonferroni. Sin embargo, para las dos primeras etapas (hidratación y diferenciación) y la tasa de eclosión final, se obtuvieron datos a todas las temperaturas y salinidades, y la importancia de los datos dentro y entre los grupos se determinó mediante un ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Bonferroni. . Las tablas de ANOVA se incluyen en la Tabla complementaria 1. Antes de realizar las pruebas de ANOVA, se examinó la normalidad de los datos utilizando un gráfico cuantil-cuantil normal con un nivel de confianza del 95%. El análisis de la correlación entre diferentes resultados se realizó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Los datos se consideraron significativos en todos los análisis estadísticos si p < 0,05.

A medida que los quistes de Artemia eclosionan, su consumo de oxígeno y su morfología sufren cambios. Como se describe en la sección de métodos, estos cambios se registraron utilizando un sensor de oxígeno en chip y un microscopio óptico. La Figura 2A muestra microfotografías de varias etapas de la eclosión. La Figura 2B muestra el agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) del agua dentro del chip para incubar. Cuando había quistes dentro del chip de eclosión, a medida que los quistes consumieron oxígeno durante todo el proceso de eclosión, la concentración de oxígeno disuelto en el agua disminuyó y, por lo tanto, el DDOC aumentó (línea continua azul). La tasa de consumo de oxígeno (ROC) en cada etapa, según lo estimado por la ecuación. (1), también se representa en la Fig. 2B (línea continua verde). Cuando el chip de eclosión contenía solo agua salada artificial pero no quistes (experimento de control), el DDOC (línea de puntos azul) y la ROC (línea de puntos verde) fueron casi insignificantes. Es importante señalar que, aunque el material del chip para incubar PDMS es permeable al oxígeno60,61, la comparación del DDOC con quistes dentro del chip con el DDOC sin quistes (control) indica que la tasa de consumo de oxígeno en todas las etapas es significativamente mayor que permeación apoyando así el uso de la presente configuración para comparar cualitativamente el DDOC en diferentes condiciones ambientales. Observamos que dado que los quistes de Artemia utilizados para la eclosión en este estudio no fueron esterilizados, existe la posibilidad de que contengan microorganismos que consuman parte del oxígeno disuelto. En este estudio no se distinguieron los efectos de los quistes y la posible presencia de microorganismos en el DDOC y se requiere más investigación. Sin embargo, como el experimento de control indica (líneas de puntos en la Fig. 2B) cambios insignificantes en el DDOC durante el período de 24 h, se puede concluir que ni el chip de eclosión ni los microorganismos potenciales en el agua salada artificial contribuyeron a los cambios en el DDOC. .

Fotomicrografías y lecturas de sensores de O2 en diferentes etapas de la eclosión. (A) Fotomicrografía en diferentes etapas de eclosión obtenida del estereomicroscopio óptico (barra de escala = 500 m). El recuadro muestra la morfología de los quistes/nauplios en diferentes etapas (barra de escala = 100 µm). (B) Detección en chip del agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) cuando había quistes de Artemia (línea continua azul) y no había quistes (línea discontinua azul de control) en el chip de eclosión a 25 °C y 25 ppt. La tasa de consumo de oxígeno (ROC) en diferentes etapas estuvo representada por líneas verdes (línea continua, con quistes, línea de puntos, control). Las líneas en negrita del gráfico muestran el promedio y el área sombreada muestra la desviación estándar. Los triángulos rojos en (B) representan el DDOC en los puntos de tiempo correspondientes a las fotomicrografías presentadas en (A).

La inmersión de los quistes en agua inicia la etapa de hidratación, en la que los quistes se inflan y adquieren una forma esférica (en lugar de copa) [Fig. 2A(i)]. A medida que los quistes absorben agua, en un corto período comienzan el metabolismo energético, la síntesis de ARN y proteínas34,62. A medida que se reactiva el metabolismo energético, la actividad respiratoria aumenta drásticamente, como lo demuestra el aumento de la ROC (Fig. 2B). Al final de la etapa de hidratación, la mayoría de los quistes tienen forma esférica y comienza la diferenciación. Además, en esta etapa, no hay división celular ni aumento en el ADN34,62, lo que resulta en un requerimiento de oxígeno bajo y casi constante y, por lo tanto, una ROC más baja (Fig. 2B). En la tercera etapa (emergencia), la cubierta del quiste comienza a fracturarse debido al aumento de la presión de turgencia en su interior como resultado de una mayor cantidad de glicerol, y el embrión comienza a emerger de la cubierta rota dentro de una membrana de eclosión [Fig. 2A(iii)]35. La etapa de emergencia es muy activa y necesita energía adicional, lo que resulta en un aumento de DDOC y ROC (Fig. 2B). Finalmente, en la última etapa (eclosión), los embriones de Artemia abandonan la cubierta del quiste y la membrana de eclosión y comienzan a nadar [Fig. 2A(iv)]. En esta etapa, la demanda de oxígeno volvió a disminuir, como lo detectó una disminución comparativa en la República de China (Fig. 2B).

La duración de cada etapa de eclosión a diversas temperaturas y salinidades se presenta en la Fig. 3. En general, observamos que a la temperatura más baja (20 °C) y/o salinidad más baja (0 ppt) en nuestro rango probado, los 24- h período de tiempo fue insuficiente para completar la eclosión debido a la duración prolongada de cada una de las tres primeras etapas, con la excepción de 20 °C a 25 ppt y 0 ppt a 30 °C. En línea con esto, se encontró que la duración de la etapa de eclosión (definida como el tiempo restante al final de la etapa de emergencia) disminuía considerablemente cuando la salinidad aumentaba a 75 ppt a 25 y 30 °C. A 20 °C (donde la etapa de eclosión se observó con solo 25 ppt de salinidad), la duración de la etapa de eclosión se redujo significativamente en comparación con todas las demás temperaturas estudiadas, independientemente de la salinidad.

Duración de las diferentes etapas de eclosión a diferentes salinidades y temperaturas del agua. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). En cada categoría (hidratación y duración de la etapa de diferenciación), las medias que no comparten la misma letra son significativamente diferentes entre sí (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05). Las etapas de eclosión que no se completaron dentro de las 24 h no se analizaron estadísticamente y se marcaron con "nc". * y # denotan una duración significativamente diferente de las etapas de emergencia y eclosión, respectivamente, a una temperatura en comparación con las otras temperaturas probadas (ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni, p <0,05). ** denota una duración de la etapa de eclosión significativamente diferente entre dos salinidades diferentes probadas (ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni, p <0,05).

Reconociendo que durante la hidratación (barras verdes, Fig. 3), los quistes secos de Artemia absorben agua por ósmosis63, el efecto de la temperatura y la salinidad se puede modelar mediante la ley de Van't Hoff64

donde Δπ es la diferencia de presión osmótica, R es la constante universal de los gases, T es la temperatura y ΔC es la diferencia de concentraciones de soluto. A medida que aumenta la temperatura (T), también aumenta la tasa de ósmosis, lo que corresponde a una disminución en la duración de la hidratación, como se ilustra en la Fig. 3. La Fig. 4A complementaria muestra la correlación negativa significativa entre la duración de la hidratación y la temperatura determinada por la correlación de Pearson. coeficiente (r = − 0,9) y un ajuste lineal entre estos parámetros (R2 = 0,99) (Figura complementaria 4B). Al mismo tiempo, el aumento de la salinidad del agua a cualquier temperatura puede disminuir la diferencia en las concentraciones de solutos internas y externas (ΔC) de los quistes, lo que debería disminuir la presión osmótica con un aumento en la duración de la hidratación. Sin embargo, los resultados experimentales indican que los cambios en la salinidad no afectaron significativamente la duración de la hidratación. Por el contrario, la duración de la diferenciación (barras azules, Fig. 3) disminuyó significativamente cuando se aumentó la temperatura o se aumentó la salinidad de 0 a 25 ppt (no varía significativamente más allá de 25 ppt) a cualquier temperatura, excepto 30 °C. Para entender esto, observamos que a través de la etapa de diferenciación, el quiste llega a la etapa de emergencia, cuando la creciente presión de turgencia inducida por la síntesis de glicerol a partir de trehalosa hace que la cáscara comience a fracturarse. Un aumento de temperatura mejora la síntesis de glicerol63, lo que a su vez acorta el período de diferenciación. El aumento de la salinidad también aumenta el nivel de glicerol35 y puede disminuir el período de diferenciación. Sin embargo, a medida que aumenta la salinidad del agua, el ambiente externo se vuelve hipertónico y existe la posibilidad de pérdida de agua celular debido al proceso de exósmosis, lo que podría alargar el período de diferenciación a mayor salinidad. La competencia entre estos dos factores opuestos podría explicar por qué no hubo diferencias significativas en la duración de la etapa de diferenciación más allá de 25 ppt de salinidad. Curiosamente, la duración de la etapa de emergencia (barras naranjas, Fig. 3) sugiere una temperatura óptima de 25 °C con una disminución significativa en la duración, en comparación con la de 20 y 30 °C. Aunque la temperatura ayuda a aumentar la presión osmótica y, por lo tanto, reduce la duración de la etapa de hidratación y diferenciación, una vez que comienza la etapa de emergencia y el embrión emerge dentro de la membrana de eclosión, parece tener menos tolerancia a temperaturas más altas. Por lo tanto, una temperatura intermedia de 25 °C fue más favorable para la etapa de emergencia y requirió menos tiempo para su finalización.

Se obtiene una mayor comprensión del proceso de eclosión examinando directamente el agotamiento de la concentración de oxígeno disuelto (DDOC) del agua en la cámara de eclosión para diferentes temperaturas y salinidades. La figura complementaria 5 muestra las curvas DDOC promedio de experimentos por triplicado realizados en cada condición de temperatura y salinidad. En general, los resultados indican una correlación positiva entre la duración de la eclosión y la DDOC para salinidades superiores a cero.

El DDOC total, o consumo total de oxígeno, para el período de eclosión de 24 h se muestra en la Fig. 4A, lo que indica la presencia de una temperatura óptima (25 °C), porque el consumo total de oxígeno es mayor a esta temperatura independientemente de la salinidad. El consumo total de oxígeno disminuyó significativamente a medida que la temperatura aumentó de 20 a 30 °C, independientemente de la salinidad. La salinidad redujo significativamente el consumo total de oxígeno sólo cuando se aumentó de 25 a 75 ppt, independientemente de la temperatura; sin embargo, no hubo cambios significativos cuando la salinidad se alteró a 30 °C, lo que sugiere una interacción significativa entre la temperatura y la salinidad. Según el peso de los quistes secos iniciales utilizados, este consumo total de oxígeno osciló entre 5,81 × 10–7 y 3,47 × 10–5 mg O2/h/mg de peso seco, con temperaturas y salinidades variables, que es comparable al consumo de oxígeno. de Artemia37, y otros huevos de crustáceos, como Anomalocera patersoni65 y Pontella mediterranea66 reportados en estudios anteriores.

Consumo de oxígeno de los quistes de Artemia bajo diferentes temperaturas y salinidades. (A) Consumo total de oxígeno, o DDOC total durante todo el proceso de eclosión bajo diferentes temperaturas y salinidades. (B) Tasa de consumo de oxígeno (ROC) en diferentes etapas de la eclosión: (i) hidratación, (ii) diferenciación, (iii) emergencia y (iv) etapa de eclosión. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). En cada categoría de datos (consumo total de oxígeno, o ROC en las etapas de hidratación y diferenciación), las medias que no comparten letras encima de las columnas son sustancialmente diferentes entre sí (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05) . A diferentes temperaturas probadas, la ROC estadísticamente significativa se indicó mediante * (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p <0,05) y ** (ANOVA de una vía con prueba post-hoc de Bonferroni, p <0,05) respectivamente, mientras que # indica un consumo total de oxígeno estadísticamente significativo (ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Bonferroni, p < 0,05).

Se obtiene una comprensión más detallada de los efectos de la temperatura y la salinidad en el proceso de eclosión considerando el consumo de oxígeno en cada una de las cuatro etapas de la eclosión. Independientemente de la salinidad, la ROC aumentó significativamente durante la hidratación cuando la temperatura aumentó de 20 °C [Fig. 4B(i)]. La ROC también disminuyó significativamente con el aumento de la salinidad entre 25 y 75 ppt, lo que refleja una menor actividad de acuerdo con la duración más larga (Fig. 3). Por otro lado, aunque tanto la salinidad como la temperatura disminuyeron la duración de la diferenciación, la tasa metabólica no se vio afectada significativamente [Fig. 4B(ii)]. Durante la etapa de emergencia, se encontró que la ROC se vio significativamente afectada por la temperatura, pero no por la salinidad en un nivel de p = 0,05 (ANOVA unidireccional), y la ROC disminuyó significativamente cuando la temperatura aumentó de 25 a 30 °C (Bonferroni, p < 0,05, figura 4B(iii)). Observamos que la significación estadística de los datos se evaluó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Bonferroni debido a una emergencia incompleta en algunas condiciones experimentales (Fig. 3). La disminución del consumo de oxígeno con el aumento de la temperatura puede indicar estrés fisiológico. Finalmente, en la etapa de eclosión, la ROC disminuyó en comparación con la etapa de emergencia, y fue máxima a 25 °C independientemente de la salinidad, y la salinidad no tiene ningún efecto sobre la ROC en esta etapa. Se observó un aumento similar en la demanda de energía durante la emergencia y una disminución después de la eclosión en otras especies de crustáceos, como Acartia tonsa67, Cherax quadricarinatus68 y Cancer pagurus69. En nuestro estudio, el consumo de oxígeno por unidad de peso seco de los quistes de Artemia en etapa de emergencia osciló entre 7,98 × 10–7 y 2,5 × 10–5 mg O2/h/mg de peso seco con diferentes temperaturas y salinidades. Basado en el límite superior, el consumo de oxígeno durante la aparición del quiste de Artemia es aproximadamente 5,54 veces menor que el del crustáceo grande Cancer pagurus69 y 0,43 veces mayor que el del crustáceo pequeño Pontella mediterranea66. Además, se observó una ROC negativa en la etapa de eclosión bajo ciertas condiciones de temperatura y salinidad. Con una salinidad de 25 ppt a 20 °C y 30 °C, esto podría deberse a un consumo de oxígeno muy bajo de la Artemia eclosionada y a una posible permeación de una cantidad muy baja de oxígeno a través del PDMS (ver Fig. 2B-experimento de control). Sin embargo, a 0 ppt/30 °C, se observó que todos los nauplios murieron después de la eclosión (sin movilidad) potencialmente debido al efecto combinado de salinidad cero y alta temperatura, y por razones desconocidas, la concentración de oxígeno del agua aumentó durante esta vez. Una posible explicación podría ser que durante el proceso de eclosión, se observó que algunos quistes liberaban burbujas de aire que inicialmente pudieron haber quedado atrapadas dentro de la cubierta del quiste. Los nauplios vivos consumirían este oxígeno extra de las burbujas de aire; pero, en este caso, debido a que no había nauplios vivos presentes, el contenido de oxígeno del agua de eclosión aumentó ligeramente. Sin embargo, se desconoce la razón exacta de este aumento del contenido de oxígeno y requiere más investigación.

La Figura 5 ilustra la tasa de eclosión (estimada utilizando la ecuación (2)) de los quistes de Artemia en nuestra plataforma a diferentes temperaturas y salinidades. De acuerdo con trabajos previos, los resultados indican la existencia de condiciones óptimas27,30. Específicamente, la tasa de eclosión aumentó dramáticamente cuando la temperatura aumentó de 20 a 25 °C, pero no hubo cambios significativos a medida que la temperatura aumentó aún más. De manera similar, la tasa de eclosión aumentó cuando la salinidad aumentó de 0 a 25 ppt a 20 y 25 °C, y de 0 a 50 ppt a 30 °C, pero posteriormente se redujo con el aumento de la salinidad. Se observó una tasa máxima de eclosión a una temperatura de 25 °C y una salinidad del agua de 25 ppt (76,85 ± 14,22%) de acuerdo con la ROC máxima medida [Fig. 4(iv)]. Además, la ROC medida indicó que las tasas de eclosión muy bajas a salinidad cero y 20 °C no reflejan necesariamente condiciones hostiles (ya que observamos actividad), pero que la duración de 24 h es insuficiente.

Cálculo de la tasa de eclosión en chip de Artemia a diferentes temperaturas y salinidades del agua. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). Las medias que no comparten la misma letra encima de las columnas son sustancialmente diferentes entre sí (ANOVA de dos vías con Bonferroni, p < 0,05).

El enfoque actual, en el que todo el proceso de eclosión se monitorea en tiempo real, avanza de manera única en la comprensión de las relaciones entre los parámetros abióticos, las características de la etapa (duración, ROC) y la tasa de eclosión. Para cuantificar estos parámetros, implementamos una correlación de Pearson. Primero observamos que aunque la República de China se vio significativamente afectada por la temperatura, la salinidad o ambas, solo la República de China en la etapa de eclosión tuvo una asociación estadísticamente significativa (correlación positiva) con la tasa de eclosión. Por otro lado, sólo la duración de la diferenciación se correlaciona significativamente con la tasa de eclosión (correlación negativa).

Se observaron correlaciones negativas entre la tasa de eclosión y la hidratación y la duración de la etapa de diferenciación y una correlación positiva entre la tasa de eclosión y la duración de la etapa de eclosión. La tasa de eclosión fue máxima cuando la temperatura y la salinidad fueron 25 °C y 25 ppt, respectivamente. A mayor o menor temperatura o salinidad entre las condiciones probadas, la etapa de hidratación y diferenciación tomó más tiempo y la etapa de eclosión fue más corta. De manera similar, el consumo de oxígeno se correlaciona positivamente con la tasa de eclosión en la etapa de hidratación y eclosión, pero negativamente con la tasa de eclosión en la etapa de diferenciación. A una temperatura de 25 °C y una salinidad de 25 ppt, el consumo de oxígeno fue comparativamente alto en la etapa de hidratación, menor durante la etapa de diferenciación y muy alto en la etapa de eclosión. Este patrón se revirtió a temperaturas o salinidades probadas muy bajas o muy altas. Estos hallazgos muestran que la temperatura y la salinidad afectan significativamente todo el proceso de eclosión. La mayor incubabilidad se obtiene en esas condiciones favorables de temperatura y salinidad, cuando la mayoría de los quistes se hidratan y recuperan una mayor tasa metabólica en un período de tiempo más corto durante la etapa de hidratación, gastan menos energía durante la etapa de diferenciación y la completan más rápidamente. En esta condición óptima, los quistes pasarán más tiempo en la etapa de eclosión, lo que resultará en una mayor cantidad de quistes que eclosionan y un mayor consumo de oxígeno.

En este trabajo, hemos demostrado que la medición de las tasas metabólicas en tiempo real y los cambios morfológicos correspondientes pueden ofrecer una comprensión mecanicista profunda de cómo los parámetros abióticos afectan el proceso de eclosión de Artemia. Centrándonos en la temperatura y la salinidad (dos parámetros ambientales importantes que también son susceptibles al cambio climático), medimos el comportamiento de la respiración, la progresión de la eclosión y el número resultante de Artemia eclosionadas bajo distintos niveles de temperatura y salinidad durante un período de tiempo predeterminado. Aunque los hábitats de Artemia están limitados por la hipersalinidad, este estudio puede arrojar luz sobre los probables impactos de la temperatura y la salinidad en el proceso de eclosión de otras especies de crustáceos más extendidas.

De acuerdo con estudios previos, se observa que salinidades extremas (bajas o altas) y bajas temperaturas inhiben la eclosión de Artemia, verificando la existencia de condiciones óptimas de eclosión26,27,28,29,30,31. Sin embargo, si bien estos estudios previos se centran principalmente en mediciones finales de la tasa de eclosión, aquí hemos establecido relaciones entre la tasa de eclosión y la progresión del comportamiento de eclosión y respiración a lo largo del proceso. Por ejemplo, demostramos que un factor clave que afecta la eclosión de Artemia en un período de 24 h es la duración de la etapa de diferenciación, que resulta ser inversamente proporcional a la tasa de eclosión. En general, la duración de la diferenciación (barras azules, Fig. 3) disminuye tanto con el aumento de la salinidad como de la temperatura, excepto en salinidades muy altas. Con base en la comprensión de la etapa de diferenciación, es posible que esta relación esté relacionada con una mayor producción de glicerol que acelera la fractura de la capa que caracteriza el inicio de la emergencia. Aunque la validación de esta hipótesis se deja para trabajos futuros, ilustramos que los experimentos actuales resaltan áreas clave de enfoque para comprender la compleja relación entre el medio ambiente y la salud de los animales acuáticos. También se demostró claramente un vínculo crucial entre la temperatura, la salinidad y la reactivación del metabolismo de los quistes latentes comparando la progresión de la hidratación con la ley de Van't Hoff.

El presente enfoque experimental fue posible mediante el desarrollo de una nueva plataforma de microfluidos con sensor de oxígeno integrado, en la que también se podían registrar los cambios físicos en los quistes de Artemia utilizando un microscopio óptico. Se obtiene un control ambiental preciso utilizando un calentador con un circuito de retroalimentación y un chip de conteo automatizado diseñado para eliminar errores asociados con la falta de un control ambiental estricto y un cálculo manual de la incubabilidad. Además de ofrecer una mirada más profunda a los procesos biológicos, el uso generalizado de sistemas automatizados con control ambiental preciso estandariza los experimentos, lo que resulta en comparaciones cruzadas más informativas en la literatura. Por lo tanto, se prevé que el presente enfoque tenga una aplicabilidad más amplia en la investigación del zooplancton y larvas de peces, incluso en diversas condiciones ambientales abióticas/bióticas y contaminantes acuáticos.

Los conjuntos de datos están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (número de premio: 2038484, año: 2020). Los gráficos se trazaron utilizando OriginPro 2022b (https://www.originlab.com/). Los esquemas se crearon utilizando Biorender (https://biorender.com/).

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PD: conceptualización, metodología, investigación, análisis formal, visualización, redacción—borrador original. TB: conceptualización, supervisión, análisis formal, redacción: revisión y edición, adquisición de financiación. AB: conceptualización, supervisión, análisis formal, redacción: revisión y edición, adquisición de financiación.

Correspondencia a Alicia Boymelgreen.

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Dey, P., Bradley, TM y Boymelgreen, A. El impacto de factores abióticos seleccionados en el proceso de eclosión de Artemia mediante la observación en tiempo real de los cambios de oxígeno en una plataforma de microfluidos. Representante científico 13, 6370 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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Recibido: 24 de enero de 2023

Aceptado: 04 de abril de 2023

Publicado: 19 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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