La metabolómica espacial revela la naturaleza multifacética de la glándula bucal de lamprea y sus diversos mecanismos para la sangre

Jun 19, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 881 (2023) Citar este artículo

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Las lampreas son vampiros chupadores de sangre en ambientes marinos. Desde una perspectiva de supervivencia, se espera que la glándula bucal de la lamprea exhiba un depósito de componentes farmacológicamente activos para modular la homeostasis y las respuestas inflamatorias e inmunes del huésped. Al analizar los perfiles metabólicos de 14 tejidos diferentes de lamprea, mostramos que dos grupos de metabolitos en la glándula bucal de las lampreas, las prostaglandinas y los metabolitos de la vía de la quinurenina, se pueden inyectar en el pez huésped para ayudar a la alimentación de la sangre de la lamprea. Las prostaglandinas son metabolitos bien conocidos asociados a la succión de sangre que actúan como vasodilatadores y anticoagulantes para mantener la homeostasis vascular y participan en las respuestas inflamatorias. La prueba de reactividad vasomotora en el anillo aórtico del bagre mostró que la quinurenina también puede relajar los vasos sanguíneos del pez huésped, mejorando así el flujo sanguíneo del pez huésped en el lugar de la picadura. Finalmente, se construyó una base de datos de metabolómica espacial de lamprea (https://www.lampreydb.com) para ayudar en los estudios que utilizan lampreas como modelo animal.

Las lampreas, junto con los mixinos, son los únicos linajes existentes de peces sin mandíbula1,2. La evidencia fósil acumulada ha demostrado que las lampreas en el período Devónico ya eran casi idénticas a las lampreas adultas modernas, con disco oral, cartílagos anulares y dientes circumorales bien desarrollados3,4,5,6, lo que sugiere la estabilidad evolutiva a largo plazo de las lampreas. .

Las lampreas son animales acuáticos con forma de anguila. Algunas especies viven en agua dulce durante toda su vida, como la lamprea coreana (Eudontomyzon morii), mientras que otras, como la lamprea marina (Petromyzon marinus) y la lamprea ártica (Lethenteron camtschaticum), suelen migrar al mar para alimentarse7. El ciclo de vida de todas las lampreas comienza con una fase larval de agua dulce (también llamada ammocoetes), en la que las larvas de lamprea viven enterradas en el sustrato de los arroyos como filtradores. Después de aproximadamente 3 a 7 años o más5,8, todas las lampreas completan la metamorfosis en lampreas juveniles, con su característico disco oral y su lengua en forma de daga. En las especies parásitas de lampreas, el disco oral y la lengua en forma de daga se utilizan para adherir y perforar la piel de los peces y permitirles ingerir sangre9. Después de un año o más, las lampreas juveniles se convierten en adultos sexualmente maduros que ya no se alimentan. Por el contrario, las lampreas no parásitas no se alimentan una vez completada la metamorfosis10,11,12. En la última etapa, las lampreas adultas regresan al agua dulce para desovar y morir7,13.

Actualmente se reconocen cuarenta especies de lamprea entre las lampreas existentes, de las cuales 18 especies son parásitas14. Casi todos los animales chupadores de sangre son invertebrados, como pulgas, garrapatas, sanguijuelas y mosquitos, y las lampreas son uno de los pocos grupos de ectoparásitos vertebrados15. Las lampreas parásitas generalmente se adhieren a la superficie del cuerpo del huésped a través de su disco oral en forma de ventosa, raspan un agujero en la piel con un pistón en forma de lengua rematado con dentículos que forman los bordes cortantes y chupan la sangre del huésped durante días. . Como tal, las lampreas parásitas deben suprimir la respuesta inmune (que puede provocar picazón o dolor y, por lo tanto, desencadenar un comportamiento defensivo en sus huéspedes), la respuesta nociceptiva (que puede iniciar un comportamiento de defensa del huésped) y la hemostasia (los mecanismos de los vertebrados que previenen la pérdida de sangre). del huésped para garantizar una alimentación sanguínea exitosa y a largo plazo. Amplios estudios han revelado que la glándula bucal de la lamprea secreta varias proteínas que funcionan como anticoagulantes, bloqueadores de canales iónicos e inmunosupresores7,15,16. Sin embargo, los metabolitos (pequeñas moléculas que actúan como productos intermedios o finales del metabolismo celular) en las secreciones de las glándulas bucales nunca se han explorado en detalle. Dada su posición filogenética única y su estatus como uno de los pocos grupos de ectoparásitos vertebrados, se espera que las lampreas hayan desarrollado distintos metabolitos específicamente adaptados para la alimentación sanguínea y el parasitismo. Detectar e identificar estos metabolitos mejorará nuestra comprensión de cómo las lampreas ingieren sangre y proporcionará nuevos conocimientos sobre el desarrollo de fármacos eficaces contra la inflamación y el alivio del dolor. Para ello, hemos realizado un análisis de metabolómica espacial de 14 tejidos diferentes de lamprea. La glándula bucal de lamprea fue investigada particularmente debido a que es un órgano chupador de sangre y se detectó en la glándula bucal un perfil metabólico inesperado, rico y único. Finalmente, hemos construido una base de datos de metabolómica espacial de lamprea para facilitar estudios en bioquímica, química clínica, descubrimiento de productos naturales, medicina y metabolómica utilizando lampreas como animal modelo.

La lamprea ártica (Lethenteron camtschaticum) se recolectó durante su fase de migración de desove adulta, cuando ya no se alimentan. Se diseccionaron cuidadosamente catorce tejidos de lamprea, es decir, corazón, hígado, riñón, cerebro, cuerpo supraneural, músculo, intestino, branquias, ojos, testículos, ovario, glándula bucal, sangre y notocorda, y se sometieron a metabolómica no dirigida utilizando cromatografía líquida de masas. espectrometría (LCMS) (Fig. 1a). La calidad de los datos sin procesar y la variación entre lotes se evaluaron en 5 muestras de control de calidad (QC) agrupadas obtenidas en modos de iones positivos y negativos (Datos complementarios 1 y 2). Además, se utilizó un estándar interno (IS), 2-cloro-L-fenilalanina, para una evaluación rápida de la variación entre lotes, y el resultado confirmó una buena reproducibilidad dentro de las muestras (Fig. 1c).

una ilustración anatómica de los 14 tejidos de lamprea sometidos a análisis metabolómicos. Cada tejido tiene una abreviatura única y se mantiene constante en todas las figuras. b Gráfico de barras que muestra el número de características de masa únicas antes y después de la limpieza de datos en los modos de iones positivos y negativos. c Gráficos de líneas que muestran las variaciones del área del pico transformada log10 del estándar interno, 4-cloro-L-fenilalanina, detectadas en los modos de iones positivos y negativos, respectivamente (n = 3 para cada tejido). La línea discontinua roja representa las áreas medias de los picos en todas las muestras, y las líneas discontinuas grises son el área media de los picos ±5% del área media de los picos. d Resumen del total de metabolitos identificados en diferentes tejidos de lamprea. Gráfico Pi que muestra el porcentaje de metabolitos identificados que pertenecen a diferentes clases químicas. Histograma que muestra la distribución de clases químicas a lo largo del rango de masas. Cada clase química está representada por un código de color único.

En total, se detectaron 6568 y 3143 características únicas en los modos de iones positivos y negativos, respectivamente (Fig. 1b). Luego se realizó una limpieza de datos para eliminar características de masa inestable sin espectro MS2 y características con espectro MS2 incorrecto (es decir, se seleccionó un ion precursor incorrecto para la fragmentación). Las características de masa resultantes de 2621 (modo de iones positivos) y 1835 (modo de iones negativos) se dejaron para la posterior identificación de metabolitos y análisis estadístico (Fig. 1b). Se realizaron anotaciones de metabolitos tentativas y putativas basadas en mediciones de masa precisas, similitud de distribución de isótopos y evaluación manual de la coincidencia del espectro de fragmentación (cuando corresponda) con nuestra base de datos interna (~3600 estándares) y mzCloud (https://www.mzcloud .org), la base de datos del metaboloma humano (https://hmdb.ca)17 y Lipid Map (https://www.lipidmaps.org)18, y todas las bases de datos públicas MS-DIAL19,20. Este paso condujo a la detección de una gran diversidad de clases de metabolitos en la lamprea; entre ellos, el ácido carboxílico y sus derivados fueron la clase más abundante (Fig. 1d).

Se aplicó el análisis de componentes principales (PCA) para el examen inicial de los perfiles metabólicos de diferentes tejidos de lamprea. Los gráficos de puntuación de PCA de los datos del modo de iones positivos y negativos revelaron que la glándula bucal estaba muy separada de todos los demás tejidos (Fig. 2a), lo que sugiere que la glándula bucal tenía un perfil metabólico distinto. El mapa de calor de agrupamiento jerárquico mostró que un tercio de las características de masa eran muy abundantes en la glándula bucal en modo de iones positivos (Fig. 2b), y más de la mitad de las características estaban enriquecidas en la glándula bucal en modo de iones negativos (Fig. 2b). Un análisis estadístico adicional mostró una acumulación significativa de metabolitos en la glándula bucal. Por ejemplo, se encontraron 127 y 182 características de masa más de 1000 veces mayores en la glándula bucal en comparación con los otros 13 tejidos (valor p ajustado por FDR <0,001) en los modos de iones positivos y negativos, respectivamente. Vale la pena señalar que normalmente no es sencillo comparar directamente los perfiles metabólicos de diferentes tejidos debido a las diferencias en los efectos de la matriz específicos de cada tejido21,22. Sin embargo, la detección igual del estándar interno (IS, 4-cloro-L-fenilalanina) en diferentes grupos de tejidos puede indicar que las diferencias en los efectos de la matriz específica del tejido no son significativas en nuestro estudio (Fig. 1c). Sin embargo, nuestro objetivo aquí no es identificar biomarcadores para distinguir la glándula bucal de cualquier otro tejido de lamprea. En cambio, aquí nos gustaría detectar metabolitos específicos de las glándulas bucales de lamprea.

Una puntuación de PCA representa gráficamente los perfiles metabólicos adquiridos en los modos de iones positivos y negativos, respectivamente (n = 3 para cada tejido, excepto n = 5 para muestras de control de calidad). b Mapas de calor de agrupamiento jerárquico de los perfiles metabólicos adquiridos en los modos de iones positivos y negativos, respectivamente (n = 3 para cada tejido, excepto n = 5 para muestras de control de calidad). Cada fila representa una muestra y cada columna representa un metabolito. Cada celda coloreada (roja arriba, azul abajo) en el mapa corresponde a una característica de masa normalizada con puntuación z.

Se sabe que las lampreas parásitas secretan proteínas que poseen actividades anticoagulantes y vasodilatadoras de las glándulas bucales durante la alimentación de sus huéspedes13. Se han realizado estudios intensivos para detectar, identificar y estudiar las funciones de esas proteínas7,13,15,16. Por el contrario, sorprendentemente se han realizado pocos estudios sobre moléculas pequeñas en las glándulas bucales de la lamprea23. Teniendo en cuenta los perfiles metabólicos ricos y únicos de la glándula bucal y su importante función biológica para promover el flujo sanguíneo desde el huésped al parásito, nos hemos centrado en la glándula bucal en los estudios posteriores para investigar el mecanismo de succión de sangre de la lamprea en el nivel funcional. nivel metabólico.

En total, se encontraron más de 1500 características de masa muy abundantes en la glándula bucal de lamprea (FC > = 10 y valor p ajustado por FDR < 0,05). Entre ellos, se identificaron provisionalmente 272 y pertenecían a más de 30 clases químicas diferentes, como acilos grasos, esteroides y derivados de esteroides. Estas características de masa específicas de las glándulas bucales son candidatas perfectas para detectar metabolitos asociados a la succión de sangre. En particular, se detectó una vía completa de quinurenina (KP) en la glándula bucal (Fig. 3a). El espectro MS/MS de cada metabolito de la vía KP, la anotación de sus fragmentos principales y los gráficos de coincidencia de bibliotecas de cabeza a cola se muestran en las figuras complementarias. 1–6. Como se muestra claramente en el mapa de calor anatómico, la mayoría de los metabolitos de KP se acumularon exclusivamente en la glándula bucal (Fig. 3a, b). Por ejemplo, la N-formilquinurenina se encontró entre 229,0 y 14676,9 veces mayor en la glándula bucal en comparación con los otros 13 tejidos, y la quinurenina fue entre 27355 y 46627,6 veces mayor en la glándula bucal (Fig. 3a). Además, también se identificó un metabolito de la vía KP específico de la glándula bucal de la lamprea, a saber, 3-hidroxiquinurenina-O-sulfato23, con valores de cambio de veces que oscilaron entre 2713,2 y 47791,6 en la glándula bucal en comparación con otros tejidos (Fig. 3a). Aunque su función aún no está clara, la detección de 3-hidroxiquinurenina-O-sulfato en otros insectos chupadores de sangre, como Rhodnius prolixus24, sugiere que podría ser un metabolito relacionado con la alimentación sanguínea. El KP tiene una velocidad limitada por sus primeras enzimas, triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) e indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que convierten el triptófano en N-formilquinurenina25,26 (Fig. 3a). Los niveles de expresión de los dos genes principales se estudiaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), y el resultado mostró que TDO se expresaba altamente en la glándula bucal, mientras que IDO estaba principalmente en el hígado (Fig. 3c).

a Representación esquemática de la vía de la quinurenina (KP). El valor de cambio (FC) se calculó para cada metabolito en la ruta dividiendo el área del pico de ese metabolito detectado en la glándula bucal por el de todos los demás tejidos de lamprea (se excluyeron las muestras de control de calidad). Luego, el rango de valores de FC se mostró debajo de cada nombre de metabolito. En la ruta se mostró la estructura química del 3-hidroxiquinurenina-O-sulfato, un metabolito KP exclusivo de la lamprea. b Se detectaron cuatro patrones de distribución espacial únicos para los metabolitos de KP. El L-triptófano se acumuló en la notocorda (encerrado en un círculo violeta); el ácido quinolínico se encontró principalmente en la glándula bucal y el hígado de la lamprea (encerrados en un círculo naranja); el ácido pipecólico fue más abundante en el riñón (encerrado en un círculo verde); y todos los demás metabolitos de KP se acumularon exclusivamente en la glándula bucal de lamprea (encerrada en un círculo azul). c la expresión relativa de triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) e indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en diferentes tejidos de lamprea. Las abreviaturas de los tejidos son las mismas que se muestran en la Fig. 1a. d Gráfico de barras que muestra los cambios en el diámetro de los vasos sanguíneos del bagre tras tratamientos con diferentes concentraciones de quinurenina. Los datos se muestran como la media ± DE (n = 3). Las figuras representativas del inserto son imágenes ópticas de los vasos sanguíneos del bagre antes y después del tratamiento con quinurenina. Los asteriscos denotan diferencias significativas (*p < 0,05; ***p < 0,001; prueba de rangos con signo de Wilcoxon) entre los vasos sanguíneos tratados con quinurenina y los tratados con PBS (control). e Se detectó una red submolecular de prostaglandinas en la glándula bucal de lamprea. Se mostraron las estructuras químicas de las 4 prostaglandinas identificadas. El rango de valores de cambio (FC) de cada prostaglandina se calculó de la misma manera que se describe en la Fig. 3a. El nodo gris representa picos de masa no identificados o fragmentos en la fuente de los metabolitos identificados. f Un mapa de calor anatómico representativo mostró que las 4 prostaglandinas estaban localizadas exclusivamente en la glándula bucal de la lamprea.

El PK ha recibido cada vez más atención hoy en día debido a sus asociaciones emergentes con la inflamación, el sistema inmunológico y las afecciones neurológicas25,26. Estas funciones únicas de KP están potencialmente asociadas con la succión de sangre de la lamprea. Además, el informe sobre la presencia de 3-hidroxiquinurenina-O-sulfato en otras especies chupadoras de sangre hace que KP sea aún más atractivo para investigar su papel en la alimentación de sangre de la lamprea. Se ha informado que la L-quinurenina, en particular, disminuye la resistencia vascular y mejora el flujo sanguíneo al relajar los vasos sanguíneos27,28. Por lo tanto, preguntamos si la L-quinurenina también podría relajar los vasos sanguíneos del pez huésped. Como tal, realizamos una prueba de reactividad vasomotora en el anillo aórtico del bagre (Silurus asotus). Como se muestra en la Fig. 3d, en comparación con el grupo de control (tratado con PBS), el diámetro de los vasos sanguíneos aumentó significativamente 15 minutos después de la adición de L-quinurenina, y el grado de aumento pareció estar asociado con las concentraciones de L-quinurenina. (Figura 3d).

Además de los metabolitos de KP, se identificaron cuatro prostaglandinas (PG), a saber, PGJ2, PGF2alfa, PGE2 y PGE3, en la glándula bucal mediante análisis de redes moleculares (Fig. 3e). El espectro MS/MS de cada prostaglandina, la anotación de sus fragmentos principales y los gráficos de coincidencia de bibliotecas de cabeza a cola se muestran en las figuras complementarias. 7–10. El mapa de calor anatómico mostró que las 4 prostaglandinas se acumulaban exclusivamente en la glándula bucal de lamprea (Fig. 3f). Por ejemplo, se encontró PGE2 entre 903,1 y 12684,1 veces mayor en la glándula bucal en comparación con todos los demás tejidos (Fig. 3e).

Durante la alimentación sanguínea, las lampreas juveniles parásitas se adhieren al pez huésped mediante sus discos orales, penetran la piel mediante la acción de sus pistones dentados en forma de lengua, crean un nicho de alimentación en el sitio de la picadura y luego comienzan a alimentarse29. Por otro lado, las defensas del anfitrión intentarán contraatacar y detener la alimentación de la lamprea en el lugar de la picadura.

En este estudio, hemos identificado dos grupos de metabolitos, es decir, metabolitos de KP y prostaglandinas, en la glándula bucal de la lamprea que pueden desempeñar funciones importantes en la alimentación de sangre de la lamprea (Tabla complementaria 5). Para verificar que estos metabolitos realmente participaron en la alimentación de sangre de la lamprea, debemos asegurarnos de que puedan ser secretados por la glándula bucal de la lamprea e inyectados en el sitio de alimentación del pez huésped. Como tal, diseñamos otra serie de experimentos y realizamos un "análisis dirigido" para monitorear los cambios en los dos grupos de metabolitos durante la alimentación con sangre de lamprea. Es importante señalar que la lamprea ártica (Lethenteron camtschaticum) no se alimenta en su etapa adulta. En lugar de ello, se utilizaron juveniles de lamprea coreana (Eudontomyzon morii) para atacar a los peces huéspedes y chupar sangre13. En resumen, sesenta lampreas fueron divididas aleatoriamente en seis grupos (10 en cada grupo). Se diseccionaron las glándulas bucales de tres grupos de lampreas y se recogió su secreción antes de chupar sangre. Otros tres grupos de lamprea fueron alimentados con bagre (Silurus asotus) durante 20 minutos y luego se recogió la secreción de sus glándulas bucales. Además, se recogieron tres sitios de muestreo del bagre, es decir, el sitio chupador de sangre y dos sitios no chupadores de sangre del huésped. En total, los análisis LCMS incluyen 5 grupos de muestras: el grupo 1 es la glándula bucal de la lamprea antes de la alimentación (BGb); el grupo 2 es el sitio de succión de sangre del bagre (BSS); los grupos 3 y 4 son sitios de control (sitios que no chupan sangre, C1 y C2) del bagre, y el grupo 5 es la glándula bucal de la lamprea después de la alimentación (BGa) (Fig. 4a). Al comparar entre BGb y BGa, podríamos saber que si las cantidades de estos metabolitos se reducen en la glándula bucal después de chupar sangre; y al comparar entre BSS, C1 y C2, pudimos comprobar si estos metabolitos se transfieren desde la glándula bucal de la lamprea al sitio de lesión del pez huésped.

a Se utilizaron cinco grupos de lampreas para el experimento de chupar sangre. El grupo 1 es la glándula bucal extraída de las lampreas antes de chupar sangre; El grupo 2 es el lugar de alimentación del pez huésped (bagre); Los grupos 3 y 4 son sitios donde no se alimenta el pez huésped; y el grupo 5 son las glándulas bucales extraídas de las lampreas después de chupar sangre. b Gráficos de puntuación del análisis de componentes principales (PCA) de los perfiles metabólicos de los 5 grupos de muestra (n = 3 para cada grupo). Medición de las áreas de pico relativas de N-formilquinurenina (c), L-quinurenina (d), ácido quinurénico (e), 3-hidroxiquinurenina (f), prostaglandina E3 (g), prostaglandina F2 alfa (h), prostaglandina E2 (i ) y prostaglandina J2 (j). Los datos se muestran como la media ± DE (n = 3). Las abundancias de metabolitos entre diferentes grupos se compararon mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA); Si se consideró significativo (valor de p <0,05), se realizó un análisis de comparación múltiple post hoc con corrección de la tasa de descubrimiento falso; ns, no significativo; *p < 0,05; **p<0,01.

El gráfico de puntuación PCA de los datos de LCMS demostró claramente una separación distinta entre los cinco grupos de muestra, lo que indica diferencias pronunciadas en sus perfiles metabólicos. (Figura 4b). Los resultados de los metabolitos de KP, es decir, N-formilquinurenina, L-quinurenina, ácido quinurénico y 3-hidroxiquinurenina, se muestran en las figuras 4c-f. Aunque no se observaron diferencias estadísticas significativas de los cuatro metabolitos de KP entre BGb y BGa (valor p ajustado por FDR> 0,05), el análisis de cambio mostró que las cantidades de los cuatro metabolitos se redujeron después de la alimentación con sangre (Fig. 4c-f). ), lo que sugiere que estos metabolitos fueron liberados por la glándula bucal de lamprea durante la succión de sangre. Por el contrario, se encontraron diferencias estadísticas significativas de tres metabolitos de KP, es decir, N-formilquinurenina, L-quinurenina y ácido quinurénico, entre BSS y C1, y entre BSS y C2 (valor p ajustado por FDR < 0,05) (Fig. 4c-e). El análisis de cambios mostró que los cuatro metabolitos estaban altamente acumulados en BSS en comparación con los sitios que no chupan sangre del pez huésped (C1 y C2), lo que demuestra que los cuatro metabolitos de KP se transfirieron desde la glándula bucal de la lamprea al sitio de succión del pez huésped. pez huésped. De manera similar, los resultados de otros cuatro metabolitos de KP, es decir, 3-hidroxiquinurenina-O-sulfato, ácido antranílico, ácido xanturénico y ácido 3-hidroxiantranílico, también confirmaron que podían secretarse desde la glándula bucal e inyectarse en el sitio de unión. de bagre (Figura complementaria S11). Aunque no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los niveles de PG en BGb y BGa (valor p ajustado por FDR> 0,05), se observó que las cantidades de los cuatro PG se redujeron en la glándula bucal después de la succión de sangre (Fig. 4g –j). Los resultados también mostraron que los cuatro PG aumentaron en BSS en comparación con C1 y C2. En particular, PGF2 alfa y PGE2 fueron estadísticamente más altos en BSS en comparación con C1 y C2 (Fig. 4h, i).

Debido a su estatus único en la evolución de los vertebrados, las lampreas se han convertido en un importante modelo animal en diversos campos de investigación2,30, como la evolución y el desarrollo de los vertebrados8,31,32, aspectos fundamentales de la neurobiología de los vertebrados31,33, la inmunidad adaptativa34,35, la coagulación sanguínea36, e identificación de compuestos bioactivos23. La metabolómica, como miembro relativamente nuevo en el campo de las "ómicas", proporciona una poderosa herramienta adicional para los estudios de lamprea. Sin embargo, todavía falta la base de datos de metabolómica específica de la lamprea. Como tal, hemos establecido LampreyDB (https://www.lampreydb.com), una base de datos de metabolómica espacial de lamprea que abarca todos los tejidos y que contiene todos los metabolitos identificados y anotados de nuestro experimento. LampreyDB permite a los usuarios explorar metabolitos específicos de lamprea con búsquedas basadas en texto, es decir, fórmula química, valor m/z o una lista de fragmentos MS/MS (Fig. 5a). La página de resumen resultante muestra una tabla que contiene todos los metabolitos coincidentes de la base de datos. Cada entrada de metabolito tiene un hipervínculo a una página de descripción de metabolito individual que contiene la siguiente información (si está disponible): nombre del metabolito, clase, fórmula química, tiempo de retención, valor m/z exacto, SMILES, inChiKey y estructura química (Fig. 5b). En la misma página se proporcionan un gráfico de espectro MS2 interactivo y un mapa de calor anatómico interactivo para cada metabolito, de modo que el usuario pueda explorar fácilmente los picos de fragmentos de cada metabolito e inspeccionar y comparar visualmente su distribución espacial. Actualmente, LampreyDB contiene información sobre más de 1000 metabolitos (2031 registros de modos de iones positivos y negativos) detectados en la lamprea.

a LampreyDB permite búsquedas basadas en texto, como el uso de fórmulas químicas, valores m/z y una lista de fragmentos de MS/MS. b LampreyDB proporciona información valiosa que incluye nombre del metabolito, clase, fórmula química, tiempo de retención, valor m/z preciso, SMILES, inChiKey, estructura química, espectro MS/MS interactivo y mapa de calor anatómico interactivo para cada metabolito en la base de datos.

Cuando intentan alimentarse de sus huéspedes, las lampreas se ven desafiadas por las defensas del huésped, como la hemostasia, la inflamación y la inmunidad. En consecuencia, para garantizar una alimentación sanguínea exitosa y continua, las lampreas han desarrollado un cóctel complejo y sofisticado de componentes de secreción de las glándulas bucales, que consiste en una variedad de proteínas, péptidos y metabolitos bioactivos, para contrarrestar las respuestas del huésped16,23. Los avances recientes en genómica, transcriptómica y proteómica han permitido el descubrimiento de diversas proteínas que exhiben actividades anticoagulantes y vasodilatadoras de la glándula bucal de lamprea7,13. Sin embargo, todavía faltan estudios sobre los metabolitos presentes en la glándula bucal de la lamprea.

En este estudio, aplicamos un enfoque de metabolómica espacial para buscar metabolitos relacionados con la alimentación de sangre de la lamprea. La metabolómica espacial es un campo de investigación ómica centrado en detectar e interpretar metabolitos en el contexto espacial de células, tejidos, órganos y organismos37. La obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) es una de las técnicas más destacadas en los estudios de metabolómica espacial, con una resolución espacial alcanzable hasta niveles celulares y subcelulares hasta la fecha38,39. Sin embargo, la cobertura molecular suele ser baja y la identificación de metabolitos es un desafío en MSI40,41,42. Por el contrario, aunque tiene una resolución espacial limitada, el enfoque de metabolómica espacial basado en LCMS proporciona una sensibilidad y una cobertura molecular sin precedentes, lo que permite una investigación más detallada del sistema biológico. Como nuestro objetivo no es mapear la distribución espacial de metabolitos en lampreas, decidimos usar LCMS para realizar un análisis metabolómico espacial de todo el tejido. Este enfoque nos permite explorar metabolitos específicos de tejido de una "manera no dirigida". Por ejemplo, al comparar los perfiles metabólicos entre diferentes tejidos de lamprea, pudimos identificar metabolitos específicos de las glándulas bucales de la lamprea. Estos metabolitos son candidatos prometedores para la detección de metabolitos relacionados con la alimentación y la sangre de la lamprea. Con este enfoque, pudimos detectar más de 1500 características de masa únicas que estaban altamente acumuladas en la glándula bucal de lamprea (FC> = 10 y valor p ajustado por FDR <0,05). Nuestro resultado implica que la glándula bucal contiene una complejidad mucho más amplia de pequeños metabolitos de lo previsto anteriormente. Análisis estadísticos adicionales, búsqueda de literatura y análisis de funciones biológicas condujeron a la identificación de dos grupos de metabolitos candidatos, es decir, los metabolitos de KP y las prostaglandinas (PG), que pueden estar involucrados en la succión de sangre de la lamprea.

El KP ha sido objeto de una intensa actividad de investigación en los últimos años con respecto al descubrimiento de nuevas e importantes funciones que desempeñan sus metabolitos, particularmente en la función neuronal e inmune25. Además de la síntesis de proteínas, el triptófano es el precursor de muchos metabolitos fisiológicamente importantes, mientras que más del 95% del triptófano se transforma en KP25,43. Para empezar, el triptófano se convierte en N-formilquinurenina mediante la acción de la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) o de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO1 y 2), y luego en quinurenina mediante la N-formilquinurenina formamidasa (FAM). . La quinurenina se metaboliza principalmente por hidroxilación a 3-hidroxiquinurenina por la quinurenina monooxigenasa (KMO), seguida de la hidrólisis de 3-hidroxiquinurenina a ácido 3-hidroxiantranílico por la quinureninasa (Fig. 3a). La KP está altamente regulada en el sistema inmunológico, donde promueve la inmunosupresión en respuesta a una infección o inflamación. Aunque IDO y TDO comparten funciones similares como mediadores de la degradación del triptófano, sus propiedades bioquímicas son bastante diferentes. IDO es una enzima monomérica menos expresada en tejidos normales y regulada positivamente durante la inflamación para suprimir la reacción inmune. En particular, IDO1 tiene un amplio espectro de actividad en la regulación de las células inmunitarias, que controla el equilibrio entre la estimulación y la supresión del sistema inmunitario en sitios de inflamación local, lo que es relevante para una amplia gama de enfermedades autoinmunes e inflamatorias26. Mientras que el TDO es un tetrámero y se expresa altamente en el hígado, donde degrada los excesos de triptófano en la dieta y produce metabolitos de KP inmunosupresores25. A diferencia de lo informado en humanos y muchas otras especies animales de que KP y su primera enzima TDO existen principalmente en el hígado, nuestros resultados de metabolómica espacial revelaron que KP y TDO estaban ubicados exclusivamente en la glándula bucal de lamprea (Fig. 3b, c). La identificación de KP en la glándula bucal de la lamprea puede implicar un mecanismo único para la alimentación sanguínea y el parasitismo de la lamprea: en lugar de desarrollar nuevas moléculas, las lampreas acumulan abundantes metabolitos de KP en su glándula bucal y, durante la alimentación sanguínea, estos metabolitos se inyectan en el sitio de la picadura. del pez huésped, sirviendo como inmunosupresores para facilitar la alimentación sanguínea continua. A diferencia de la TDO, que existía principalmente en la glándula bucal de la lamprea, la IDO se expresó principalmente en el hígado de la lamprea y su nivel de expresión en la glándula bucal fue insignificante (Fig. 3c). Sin embargo, la teoría principal que subyace a la función inmunosupresora de estas enzimas está asociada con sus propiedades catabólicas canónicas del triptófano: el agotamiento del triptófano mediado por TDO e IDO y la acumulación de quinurenina y otros metabolitos de KP conducen a la supresión de las células efectoras inmunes y a la regulación positiva. activación y/o inducción de células inmunes tolerogénicas44. Además, el experimento de vasodilatación en bagre demostró que, además de funcionar como inmunosupresor, la quinurenina también puede relajar los vasos sanguíneos del pez huésped, mejorando así el flujo sanguíneo del pez huésped en el lugar de la picadura (Fig. 3d). KP es una vía bien estudiada y se han dilucidado las estructuras y funciones de sus metabolitos. En este estudio, también detectamos un metabolito de KP rara vez reportado, a saber, O-sulfato de 3-hidroxiquinurenina, en la glándula bucal de lamprea (Fig. 3a). Este metabolito se identificó por primera vez en la lamprea por la ref. 23, pero también se ha informado en insectos hematófagos, como Rhodnius prolixus24, lo que sugiere que es un metabolito relacionado con la alimentación de sangre.

Las prostaglandinas (PG) son componentes eicosanoides derivados del ácido araquidónico mediante tres reacciones enzimáticas secuenciales. Actúan como "hormonas locales" y regulan una gran cantidad de procesos fisiológicos45,46. Los PG son un grupo de metabolitos relacionados con los chupadores de sangre bien estudiados y se han descubierto en muchos chupasangres, incluidas las garrapatas47,48,49,50, los piojos del salmón51,52 y las sanguijuelas del bosque46. Entre ellas, la PGE2 es la PG que se encuentra con mayor frecuencia en las secreciones y ha demostrado alimentación parasitaria prolongada (anticoagulante), aumento del flujo sanguíneo al sitio de unión (vasodilatación) y/o evasión de las respuestas inmunes del huésped (inmunomodulador)49. Otra función importante de la PGE2 es movilizar Ca2+ y estimular la secreción de proteínas anticoagulantes durante la alimentación sanguínea53. También se ha informado que la PGE2 podría inhibir la migración de fibroblastos a la lesión de alimentación, inhibiendo así la cicatrización de la herida49. Además de la PGE2, la PGF2 alfa también se detectó comúnmente en chupasangres con funciones informadas de vasodilatación, inhibición de la agregación plaquetaria, antiinflamación y alivio del dolor46,47. En este estudio, hemos detectado otras dos PG, es decir, PGJ2 y PGE3, en la glándula bucal de lamprea. Se sabe que tanto PGJ2 como PGE3 tienen propiedades antiinflamatorias54. Aunque no se han descrito en otras especies hematófagas, resulta tentador especular sobre una función de los dos PG en la alimentación de sangre y el parasitismo. Curiosamente, los cuatro PG se acumularon exclusivamente en la glándula bucal de lamprea (Fig. 3f), mientras que su precursor ácido araquidónico se encontró en la mayoría de los tejidos (Fig. 12 complementaria). La detección de PG en lampreas sugirió que las lampreas pueden compartir una estrategia de succión de sangre similar a la de otros chupasangres.

Si bien nuestro enfoque en este estudio está en los metabolitos relacionados con la alimentación sanguínea en las lampreas, vale la pena señalar que las lampreas contienen una amplia gama de metabolitos que cumplen diversas funciones biológica y fisiológicamente importantes. Por ejemplo, identificamos un ácido biliar sulfatado llamado sulfato de petromizonol, que actúa como una feromona sexual única para las lampreas55,56, y sus distribuciones parecen ser particularmente específicas de cada tejido (Figura 13 complementaria). Dado que la información metabólica resuelta espacialmente es de gran beneficio para muchos estudios que utilizan la lamprea como modelo animal, hemos creado una base de datos de metabolómica espacial de la lamprea (https://www.lampreydb.com), que incluye información detallada cualitativa, cuantitativa y de distribución espacial. de cada metabolito. Los usuarios pueden consultar y comprobar fácilmente sus metabolitos de interés y/o identificar picos desconocidos en esta base de datos. La versión actual de LampreyDB incluye información sobre más de 1000 metabolitos (2031 registros de modos de iones positivos y negativos). Ahora estamos aplicando un enfoque de metabolómica basado en RMN asistida por fraccionamiento para identificar los picos de masa desconocidos de diferentes tejidos de lamprea para que podamos aumentar la cantidad de metabolitos y mejorar la calidad y confiabilidad de la información en LampreyDB en un futuro cercano.

Desde la perspectiva de un chupasangre, el paraíso es un lugar donde la sangre del huésped no coagula, el flujo sanguíneo es intenso en el lugar de alimentación y el huésped no resistirá ni dañará a los invitados. Si bien la realidad es otra. Los huéspedes vertebrados están equipados con tres armas eficientes que luchan contra los comportamientos de alimentación de sangre: hemostasia, inflamación e inmunidad57. Los animales chupadores de sangre han desarrollado muchas estrategias diferentes para triunfar contra todas las complejas barreras impuestas por sus anfitriones. Los estudios han demostrado que casi todos los artrópodos chupadores de sangre tienen al menos un componente anticoagulante, un vasodilatador y un antiplaquetario y, en muchos casos, hay más de una sustancia presente en cada categoría. En nuestro estudio, demostramos que además de depender de varias proteínas y péptidos activos, las lampreas también secretan muchos metabolitos de sus glándulas bucales para contrarrestar las respuestas del huésped y garantizar una alimentación sanguínea continua y exitosa. Se sabe desde hace mucho tiempo que la mayoría de los metabolitos de KP son inmunosupresores, y nuestro estudio demostró que la quinurenina también funciona como vasodilatador en las lampreas. Aunque KP ha sido bien estudiado, una diferencia sorprendente en nuestro estudio es que los metabolitos de KP y la primera enzima TDO se encuentran exclusivamente presentes en la glándula bucal, lo cual es diferente de lo reportado en otros animales y humanos en que los metabolitos de KP y TDO existen principalmente. en hígado. Esto puede implicar un mecanismo de alimentación de sangre único en las lampreas. Los PG son un grupo de metabolitos conocidos relacionados con la succión de sangre en otros animales chupadores de sangre. Se ha demostrado que poseen múltiples funciones para ayudar a la alimentación sanguínea, como aumentar la vasodilatación, suprimir la inflamación e inhibir la cicatrización de heridas. La identificación de PG en lampreas sugiere que todos los chupasangres pueden compartir algunas estrategias similares de alimentación de sangre. Estos hallazgos demuestran la naturaleza compleja de la glándula bucal de la lamprea y resaltan la diversidad en los mecanismos utilizados para chupar sangre en las lampreas.

Todos los productos químicos y disolventes eran de calidad analítica o HPLC. Se adquirieron agua, metanol, acetonitrilo y ácido fórmico de CNW Technologies GmbH (Düsseldorf, Alemania). La L-2-clorofenilalanina era de Shanghai Hengchuang Bio-technology Co., Ltd. (Shanghai, China). El L-triptófano se compró en Sangon (Shanghai, China) y la L-quinurenina en Macklin (Shanghai, China).

La lamprea ártica adulta (Lethenteron camtschaticum) en etapa de migración de desove se obtuvo en diciembre de 2020 en el río Songhua en la provincia de Heilongjiang en China. Se diseccionaron cuidadosamente catorce tejidos diferentes de lamprea, es decir, corazón, hígado, riñón, cerebro, cuerpo supraneural, músculo, intestino, branquias, ojos, testículos, ovario, glándula bucal, sangre y notocorda, y se lavaron en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). : tampón fosfato 10 mM, cloruro de potasio 2,7 mM, cloruro de sodio 137 mM, pH 7,4). La secreción de la glándula bucal de lamprea se recogió a través de una jeringa. Todas las muestras se congelaron instantáneamente en N2 líquido y se almacenaron a -80 ° C antes del análisis LCMS.

La lamprea juvenil parásita coreana (Eudontomyzon morii) se obtuvo en diciembre de 2020 en el río Yalu, en la provincia de Liaoning, China, y se utilizó para un experimento de alimentación de sangre. Sesenta lampreas se dividieron aleatoriamente en seis grupos (10 en cada grupo) y se mantuvieron en agua dulce a 10 ± 2 °C en luz tenue sin alimentación durante 72 h. Se diseccionaron las glándulas bucales de tres grupos de lampreas y se recogió su secreción mediante jeringas antes de chupar sangre. Otros tres grupos de lamprea fueron alimentados con bagre (Silurus asotus) durante 20 minutos y luego se recogió la secreción de sus glándulas bucales. Además, se recogieron tres sitios de muestreo del bagre, es decir, el sitio chupador de sangre y dos sitios del huésped que no chupan sangre. En total, los análisis LCMS incluyen 5 grupos de muestras: el grupo 1 es la glándula bucal de la lamprea antes de la alimentación (BGb); el grupo 2 es el sitio de succión de sangre del bagre (BSS); los grupos 3 y 4 son sitios de control (sitios que no chupan sangre, C1 y C2) del bagre, y el grupo 5 es la glándula bucal de la lamprea después de la alimentación (BGa). Todos los tejidos se almacenaron a -80 ° C antes de la extracción del metabolito.

El manejo de lampreas y bagres fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación y Bienestar Animal del Instituto de la Universidad Médica de Dalian (número de permiso: AEE17013).

Para extraer las muestras, se agregaron 30 mg de cada muestra, 20 μL de IS (L-2-clorofenilalanina, 0,3 mg/mL) y 400 μL de solución de extracción (80% metanol/agua, v/v) en un tubo Eppendorf de 2 mL. , seguido de la adición de dos pequeñas bolas de acero. Después de preenfriar el tubo a -20 ° C durante 2 minutos, cada muestra se molió a 60 Hz durante 2 minutos utilizando un molino Tissuelyser-48 (Jingxing Limited Company, Shanghai, China). El extracto resultante se agitó brevemente y se sonicó a temperatura ambiente (25–28 °C) durante 10 minutos. Posteriormente los extractos se centrifugaron a 13.000 rpm y 4 °C durante 10 min. A continuación, se transfirieron 300 µl del sobrenadante a un vial de vidrio marrón y se secaron utilizando un secador centrífugo de concentración por congelación. A cada muestra se le añadieron 300 µL de una mezcla de metanol y agua (1/4, v/v). La mezcla se agitó durante 30 s y luego se colocó a -20 °C durante 2 h. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 13.000 rpm y 4 °C durante 5 min. Los sobrenadantes resultantes (150 μl) de cada tubo se recogieron utilizando jeringas de cristal, se filtraron a través de un filtro de PTFE de 0,22 μm (Acrodisc® CR 13 mm; PALL) y se transfirieron a viales de LC para análisis de LCMS. Se prepararon muestras de control de calidad agrupadas combinando alícuotas de 20 µl de cada muestra extraída.

Se utilizó un sistema UHPLC Dionex Ultimate 3000 equipado con un espectrómetro de masas Orbitrap de cuadrupolo Q-Exactive equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) calentada (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para el análisis de metabolómica espacial en modos de iones positivos y negativos. Se empleó una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (1,8 μm, 2,1 × 100 mm). El sistema de elución en gradiente binario consistió en (A) agua (que contiene 0,1 % de ácido fórmico, v/v) y (B) acetonitrilo (que contiene 0,1 % de ácido fórmico, v/v) y la separación se logró utilizando el siguiente gradiente: 5 % de B durante 0 a 2 min, 5 a 25 % de B durante 2 a 4 min, 25 a 50 % de B durante 4 a 8 min, 50 a 80 % de B durante 8 a 10 min, 80 a 100 % de B durante 10 a 14 min, el La composición se mantuvo al 100 % de B durante 1 min, luego de 15 a 15,1 min, del 100 % al 5 % de B y de 15,1 a 18 min al 5 % de B. El caudal fue de 0,35 ml/min y la temperatura de la columna fue de 45 °C. . Todas las muestras se mantuvieron a 4 °C durante el análisis. El volumen de inyección fue de 2 μL. El rango de masas fue de m/z 66,7 a 1000,5. La resolución se fijó en 70.000 para los escaneos MS completos y 35.000 para los escaneos HCD MS/MS. La energía de colisión se fijó en 10, 20 y 40 eV. El espectrómetro de masas funcionó de la siguiente manera: voltaje de pulverización, 3800 V (+) y −3000 V (-); caudal de gas envolvente, 35 unidades arbitrarias; caudal de gas auxiliar, 8 unidades arbitrarias; temperatura capilar, 320 °C. Los controles de calidad se inyectaron a intervalos regulares (cada 10 muestras) durante todo el análisis para proporcionar un conjunto de datos a partir del cual se pueda evaluar la repetibilidad.

La calidad de los datos sin procesar se verificó primero utilizando el paquete R RawHummus58 en muestras de control de calidad en modo de iones positivos y negativos. Los informes de control de calidad resultantes se muestran en los Datos complementarios 1-2. El preprocesamiento de datos y la identificación de metabolitos se realizaron utilizando tres herramientas de software diferentes, es decir, Compound Discoverer (v.3.3, Thermo Scientific), Progenesis QI (v.2.3, Waters) y MS-DIAL (v.4.0)19,20. . De los cuales, Progenesis QI y MS-DIAL se utilizaron principalmente para fines de identificación de metabolitos. Para cada software de procesamiento de datos, se ajustaron múltiples parámetros y las configuraciones optimizadas se resumieron en la Tabla complementaria 1-3.

La base de datos LampreyDB (https://www.lampreydb.com) se organizó con MySQL (v.8.0) y Django (v.3.0.6). La interfaz web fue desarrollada utilizando HTML con JavaScript. El mapa de calor de anatomía interactivo se produjo con un script escrito en casa y el paquete Python beautiful Soup (https://pypi.org/project/beautifulsoup4/). Otras figuras, como los gráficos del espectro de MS, se produjeron utilizando el paquete Python plotly (https://plotly.com/python/). LampreyDB está alojado en el servicio en la nube de Microsoft Azure.

Los marcos de lectura abiertos (ORF) completos de Lj-TDO (triptófano 2,3-dioxigenasa), Lj-AADAT (aminoadipato aminotransferasa), Lj-IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) y Lj-KMO (quinurenina monooxigenasa) ) los genes se obtuvieron mediante PCR. Se utilizó Primer Premier 5.0 para diseñar cebadores de PCR específicos en marco de lectura abierto. Las secuencias de todos los cebadores utilizados para la síntesis de genes se enumeran en la Tabla complementaria 4. Las secuencias de aminoácidos de TDO, AADAT, IDO) y KMO se obtuvieron de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/) y almacenado en formato FASTA. Estas secuencias se utilizaron para alineamientos de secuencias y análisis bioinformáticos posteriores. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando el software ClustalW. Las secuencias alineadas resultantes se utilizaron para construir árboles filogenéticos mediante el método Neighbor-Joining (NJ), con 1000 réplicas de arranque implementadas en el software MEGA-X59. Durante el análisis se utilizó la opción de eliminación por pares para tener en cuenta las lagunas y los datos faltantes. Los motivos conservados se obtuvieron de la maximización de expectativas múltiples en línea (MEME, http://meme-suite.org/tools/meme) y se seleccionó el número de motivos: 15. Los resultados de la búsqueda se extrajeron con el software TBtools. Los dominios de proteínas funcionales conservados se predijeron con la herramienta de investigación de arquitectura modular simple (SMART, //smart.embl-heidelberg.de/). Para comprender mejor la evolución de la familia de genes entre vertebrados sin mandíbula y con mandíbula, se realizó el entorno de genes vecinos de TDO, AADAT, IDO y KMO de animales representativos utilizando la herramienta en línea Genomicus (https://www.genomicus.bio.ens. psl.eu/genomicus-92.01/cgi-bin/search.pl) y la base de datos Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html). El análisis de la estructura genética se realizó utilizando la base de datos Ensembl. Se utilizó SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive) en línea para predecir la estructura 3D de Lj-TDO, Lj-AADAT, Lj-IDO y Lj-KMO.

Las muestras de ARN total se aislaron por separado de los leucocitos, ovarios, cerebro, hígados, músculos, branquias, glándulas orales, intestinos, corazones, riñones, testículos y cuerpos supraneurales mediante el uso de reactivo RNAiso (TaKaRa, China). Los leucocitos se recogieron de la sangre circulada. Luego, el ADNc se sintetizó utilizando el kit HiScript®II Q Select RT SuperMix para qPCR (+ limpiador de ADNg) (Vazyme, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores específicos para qPCR se diseñaron utilizando el programa Primer Premier 5.0 y las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla complementaria 4. La qPCR se llevó a cabo en reacciones de 20 µL de 2 × chamQ SYBR Color qPCR Master Mix (bajo ROX Rremixed) (Vazyme Biotech, China), cebador directo (10 µM), cebador inverso (10 µM) y ADNc 200 ng. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con el sistema qTOWER 2.0 Real Time PCR System y el siguiente programa: 30 s a 95 °C, 40 ciclos de 10 s a 95 °C y 30 s a 60 °C. El cambio en el ciclo umbral (∆CT) se calculó restando el CT promedio del ARNm de Lj-GAPDH del CT promedio de los genes diana. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

La reactividad vasomotora se midió adaptando el protocolo descrito en otro lugar27. En resumen, se diseccionaron aortas de bagre, se cortaron en anillos aórticos de 1,8 a 2,0 mm y se colocaron en una placa de cultivo. Luego se confirmó la viabilidad mediante constricción incremental a soluciones con alto contenido de potasio (KCl) con una concentración final de 60 mmol/L. A continuación, los anillos aórticos se preincubaron con 60 mmol/l de KCl, se contrajeron previamente hasta la respuesta máxima y luego se midieron los diámetros de los vasos sanguíneos bajo un microscopio estereoscópico. Finalmente, los diámetros de los vasos se registraron 15 minutos después de la adición de diferentes concentraciones de soluciones de quinurenina (es decir, 2 mM, 4 mM y 8 mM). Se añadió PBS como grupo de control en blanco y todas las mediciones se repitieron cinco veces (n = 5).

Todo el procesamiento y las pruebas de hipótesis nulas se realizaron utilizando R60 (versión 4.2.3). Para comparar la abundancia relativa de metabolitos entre diferentes grupos de tejidos, se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA); Si se consideró significativo (valor de p <0,05), se realizó un análisis de comparación múltiple post hoc con corrección de la tasa de descubrimiento falso. PCA se realizó con el paquete R MSBox (https://cran.r-project.org/web/packages/MSbox/index.html); El mapa de calor y el análisis de agrupamiento jerárquico se realizaron utilizando el paquete R pheatmap (https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html). Otras figuras, como diagramas de barras y diagramas de líneas, se produjeron utilizando los paquetes R ggplot261 y ggbreak62. Los datos se representan como medias ± DE de la media (n = 3).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los archivos de secuencias utilizados en este estudio están disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (número de acceso: ON814546, ON814547, ON814548 y ON814549). Los datos de metabolómica se han archivado en MetaboLights con el identificador MTBLS5857. La base de datos de metabolómica espacial de lampreas está disponible públicamente en https://www.lampreydb.com. Los datos de origen numéricos subyacentes a todos los gráficos y tablas se pueden encontrar en los Datos complementarios 3 y 4.

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Este trabajo fue financiado por la Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31772884, 32070518), el Académico de Escalada de Liaoning, el Profesor Distinguido de Liaoning (No. XLYC2002093), el Proyecto del Departamento de Educación de la Provincia de Liaoning (No. LJKZ0962), Abierto Fondo del Laboratorio Clave de Biotecnología y Utilización de Biorecursos (Universidad Dalian Minzu) y Ministerio de Educación (Nº KF2022003).

Estos autores contribuyeron igualmente: Meng Gou, Xuyuan Duan, Jun Li, Yaocen Wang.

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Normal de Liaoning, Dalian, 116081, China

Meng Gou, Xuyuan Duan, Jun Li, Yaocen Wang, Qingwei Li y Yue Pang

Centro de Investigación de Lamprea, Universidad Normal de Liaoning, Dalian, 116081, China

Meng Gou, Xuyuan Duan, Jun Li, Yaocen Wang, Qingwei Li y Yue Pang

Instalaciones básicas de ciencias biológicas, Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, 7610001, Israel

Yonghui Dong

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MG, YP, QL e YD diseñaron y dirigieron el estudio. MG, XD, JL y YW realizaron todos los experimentos. MG e YD realizaron análisis de datos. MG, XD e YD prepararon la base de datos LampreyDB. YD escribió el borrador. Todos los demás autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Yue Pang o Yonghui Dong.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Michael Wilkie y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Gou, M., Duan, X., Li, J. et al. La metabolómica espacial revela la naturaleza multifacética de la glándula bucal de la lamprea y sus diversos mecanismos de alimentación de sangre. Común Biol 6, 881 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05250-x

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Recibido: 04 de diciembre de 2022

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 28 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05250-x

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