Actividad reductora del colesterol in vitro del micelio de Ganoderma australe basada en espectrometría de masas, sincrotrón de Fourier

Apr 23, 2024

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13619 (2023) Citar este artículo

310 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Los micelios se cultivaron a partir de un hongo silvestre tailandés identificado como Ganoderma australe según la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y análisis morfológicos. Los extractos de micelio se examinaron para determinar sus ingredientes activos mediante un método de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC‒MS/MS). Esto reveló la presencia de lovastatina y compuestos provisionales que incluyen p-cumárico, nicotinamida, ácido gamma-aminobutírico, colina, nucleósidos, aminoácidos y sacáridos. Los extractos tuvieron un efecto inhibidor sobre la actividad de la HMG-CoA reductasa de forma dependiente de la concentración. A 2,5 mg/ml, los extractos de G. australe no interfirieron con la viabilidad de los esferoides HepG2, pero su composición bioquímica se alteró según lo determinado por espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). El perfil lipídico de los esferoides tratados con el extracto de micelio fue distinto del control y del tratamiento con lovastatina 5 µM, correspondiendo con la producción de colesterol por los esferoides. Los micelios de G. australe aumentaron el porcentaje de producción de lipoproteínas de alta densidad (HDL) a 71,35 ± 2,74 %, en comparación con los esferoides control y tratados con lovastatina (33,26 ± 3,15 % y 32,13 ± 3,24 %, respectivamente). Este estudio reveló el efecto superior de las mezclas de compuestos naturales a la lovastatina pura y el uso potencial de la G. australe silvestre de Tailandia como alimento funcional para prevenir o aliviar la hipercolesterolemia.

La hipercolesterolemia es uno de los principales factores de riesgo de enfermedad cardiovascular1, que fue el octavo factor de riesgo más importante de mortalidad mundial en 20192. Las estatinas son un grupo de medicamentos recetados para el tratamiento del colesterol plasmático alto y las enfermedades cardiovasculares3; sin embargo, no se recomienda su consumo a largo plazo por sus efectos secundarios sobre los músculos4. Esto hace que el tratamiento alternativo con nutracéuticos sea una opción prometedora5, incluido el uso de hongos como alimentos funcionales6, debido a la presencia de compuestos bioactivos. Además, cada vez hay más pruebas que demuestran que los hongos comestibles mejoran los perfiles lipídicos y reducen el riesgo de enfermedades cardiovasculares7.

Ganoderma es un género de hongos de la familia Ganodermataceae y uno de los hongos medicinales para el ser humano más importantes a nivel mundial8. El género Garnoderma contiene varias especies que se han utilizado para tratamientos médicos, incluidas propiedades anticancerígenas9 para la diabetes10, inmunomodulación11 y enfermedades cardiovasculares y metabólicas12. Los compuestos bioactivos asociados con dichas funciones médicas incluyen triterpenoides, polisacáridos, esterol y alcaloides13. Si bien se ha estudiado la biodiversidad de los hongos en Tailandia14, aún no se ha informado de la identificación de un hongo cultivado naturalmente en Tailandia con la función potencial de tratamiento de la hipercolesterolemia.

En este sentido, un hongo silvestre con morfología de Ganoderma spp. fue recolectada, cultivada por sus micelios e identificada a nivel de especie. La lovastatina y los componentes biológicos de los micelios extraídos con etanol se identificaron mediante espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). Se investigó su uso potencial para el tratamiento de la hipercolesterolemia basándose en la actividad inhibidora de la HMG-CoA reductasa. Además, se dilucidaron la citotoxicidad, los grupos funcionales característicos (usando FTIR) y la producción de colesterol (basada en células hepáticas tridimensionales) en respuesta al extracto micelial de Ganoderma australe.

Los hongos silvestres se recolectaron en la Estación de Capacitación e Investigación Agroforestal de Trat, Provincia de Trat, Tailandia (12° 23′ 34″ N, 102° 40′ 32″ E). La recolección del hongo y la realización de la investigación experimental relacionada cumplieron con las directrices nacionales de Tailandia. Los cuerpos fructíferos se extrajeron cuidadosamente del sustrato. Sus características morfológicas fueron identificadas y descritas siguiendo a Luangharn et al.15. Se depositó un ejemplar de este material para uso público en el Herbario Forestal de Bangkok (BKF), Tailandia, como T. Kaewgrajang & S. Mangkalad G1-09102018 (BKF, colecciones secas y espirituosas).

Para obtener el cultivo, se aisló el tejido interior no contaminado de la muestra del hongo en agar patata dextrosa (PDA). Luego, los micelios que crecieron a partir de los trozos de hongo transferidos sin contaminación se subcultivaron en nuevos medios de agar. Se cultivaron micelios puros en PDA cubierto con celofán durante 7 a 10 días a temperatura ambiente (25 a 33 °C) antes de investigar las especies de hongos y realizar la extracción de componentes bioactivos utilizando aproximadamente 200 placas por lote.

La identidad genética de Ganoderma australe se confirmó utilizando la región espaciadora transcrita interna (ITS) que cubre 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 y parte del ADNr 28S. La región ITS se amplificó utilizando los cebadores ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') y las condiciones de PCR descritas previamente16. Luego, las secuencias de nucleótidos se analizaron utilizando el sistema MiSeq (Illumina) con secuenciación taq de código de barras basada en NGS (BTSeq™). La identidad de las especies se realizó basándose en una búsqueda en la base de datos utilizando el programa BLASTN17 en la base de datos NCBI, y las secuencias que mejor coincidían se recuperaron de la base de datos para el análisis filogenético junto con las secuencias del estudio actual. La secuencia determinada en el estudio actual se depositó en la base de datos del NCBI con el número de acceso OP727592.

Los micelios se retiraron de las placas de cultivo, se secaron a 50 °C durante 5 h y se molieron con un mortero. Se mezclaron cien miligramos de micelio seco con 1 ml de etanol al 95% y se agitaron a 180 vueltas por minuto a 37 °C durante 24 h. El compuesto extraído se recogió después de una centrifugación en frío a 8000 RPM durante 15 minutos y se filtró a través de papel Whatman No. 1. El sobrenadante se colocó en un horno de aire caliente a 60 °C para eliminar el etanol. Los extractos secos se pesaron y luego se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) para su posterior análisis.

El extracto seco se reconstituyó en DMSO, se diluyó con etanol y se filtró antes del análisis utilizando un analizador de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Shimadzu e Hitachi) en fase inversa con una columna C18 (TOSOH). El proceso de separación se llevó a cabo utilizando el tampón A (ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % y el tampón B (acetonitrilo al 100 % y TFA al 0,1 %) como fase móvil. A un caudal constante de 1 ml/min, el tampón B se aumentó a 40% en 4 minutos y luego aumentó lentamente a 44% durante los siguientes 8 minutos antes de aumentar rápidamente a 64% durante 2 minutos. Aumentó lentamente a 68% durante 8 minutos durante el tiempo de retención esperado de lovastatina. El proceso finalizó aumentando buffer B al 100% durante 2 min y mantener durante 4 min antes de reacondicionar la columna con 100% buffer A durante 5 min. El perfil se determinó usando un analizador UV a λ = 240 nm. Los datos se adquirieron usando el software Primaide System Manager. El análisis cromatográfico se llevó a cabo para el estándar de lovastatina en varias concentraciones (rango 0,625–20 µM), los extractos de micelio a 10 µg/mL de 3 extractos diferentes cultivados y enriquecidos con lovastatina que contenían concentraciones finales de 20 µM de lovastatina y 8 µg/mL. extracto La cantidad de estándar de lovastatina se calculó a partir de la curva de calibración del área del pico en un tiempo de retención de 19,0 min. El límite de detección (LOD) se calculó a partir de la curva estándar utilizando la fórmula LOD = 3,3 × (σ/s) donde σ es la DE de la intersección y s es la pendiente de la curva.

Se recogieron fracciones de HPLC con el mismo tiempo de retención que la lovastatina a partir de 3,2 mg de extracto crudo, se sometieron a análisis de espectrometría de masas (micrOTOF-Q III) con ionización por electropulverización y se operaron en modo de polaridad positiva en las siguientes condiciones: rango m/z 50–600 ; voltaje capilar, 4500 V; tensión de compensación de la placa final, − 500 V; celda de colisión RF, 100,0 Vpp; nebulizador, 0,3 bar; temperatura del calentador, 180 °C; y caudal de gas seco, 4,0 L/min. La presencia de lovastatina en la fracción se confirmó adicionalmente mediante MS/MS (SCIEX, X500R QTOF) en modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) para adquirir espectros de masas. El valor del ion precursor objetivo de lovastatina fue 405,26 Da y se ionizó utilizando un gas fuente de iones (20 psi), un gas de colisión (7 psi) y un gas de cortina (25 psi). El tiempo de vuelo de los iones se operó en modo de polaridad positiva en las siguientes condiciones: rango de exploración m/z, 100–450; voltaje de pulverización, 5500 V; potencial de desagrupación, 80 V; y tiempo de acumulación, 0,1 s. Los patrones isotópicos y espectrales de masas se compararon con el disolvente blanco y el estándar de lovastatina.

Los biocomponentes en el extracto etanólico de micelio se analizaron mediante LC‒MS/MS en NSTDA, Tailandia, de acuerdo con el protocolo informado18. Los extractos secos se reconstituyeron en metanol y se filtraron a través de una membrana de PTFE de 0,22 µm antes de llevar a cabo la separación cromatográfica. Cada muestra (2 µl) se sometió a UHPLC equipada con una columna Hypersil GOLD™ VANQUISH™ (100 × 2,1 mm, tamaño de partícula: 1,9 µm con un caudal de 0,4 ml/min). El análisis se inició con 5% acetonitrilo (ACN): 95% H2O durante 4 min seguido de un aumento a 90% ACN: 10% H2O durante 10 min que se mantuvo durante 4 min. Luego, se cambió la fase móvil a 5% ACN: 95% H2O durante 0,5 min, que se mantuvo durante 25 min.

El análisis espectral de masas se llevó a cabo utilizando Orbitrap en modo de escaneo completo. El rango de masas era de 100 a 1500 m/z con una resolución de 120.000. Para el modo dd-MS2, la resolución fue de 30.000 con energías de colisión (NCE escalonada) de 10, 30 y 50 para los modos de ionización positiva y negativa.

Los datos se analizaron utilizando el software Compound Discoverer 3.1.0.305 con un flujo de trabajo de metabolómica no dirigido. Los espectros primarios se compararon con las bases de datos ChemSpider, Composición prevista, Metabolika Pathway, mzCloud y mzVault. Se identificaron tentativamente los compuestos que mostraron coincidencias con 1 o 2 bases de datos. Se obtuvo una confirmación adicional al comparar completamente sus espectros de masas secundarios con mzCloud, mzVault y una biblioteca interna (mzVault) que contiene patrones de fragmentación de estándares analizados previamente. Se identificaron compuestos bioactivos provisionales comparando los espectros LC-MS y MS/MS con un mínimo de 3 de las bases de datos mencionadas anteriormente, al tiempo que se consideró la evidencia bibliográfica de su presencia específicamente en hongos.

La inhibición de la síntesis de colesterol de novo se determinó utilizando un kit de ensayo de HMG-CoA reductasa (Sigma-Aldrich). Se mezclaron varias concentraciones de extracto de micelio en el rango de 0,0125 a 2,5 mg/ml con la mezcla de reacción que contenía tampón, NADPH, HMG-CoA y HMG-CoA reductasa.

La pravastatina proporcionada con el kit se utilizó como control positivo, con DMSO como control negativo (NC). La actividad se monitoreó en base a la reducción de NADPH midiendo la absorción a 340 nm a 37 °C cada 10 s durante 10 min. La actividad de cada reacción se calculó utilizando el mismo rango de tiempo durante la velocidad inicial de la enzima mostrada (actividad = ∆A340/∆T). Luego, se calculó la inhibición (%) de la HMG-CoA reductasa utilizando la siguiente fórmula:

La línea celular HepG2 se adquirió de ATCC y se cultivó en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina antibiótica al 1%. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 al 5% a 37 °C. Durante el subcultivo, las células se separaron mediante tripsinización. Las células bien cultivadas se recogieron y se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5000 células por pocillo y se incubaron durante 48 h, y la viabilidad de las células HepG2 2-D se determinó basándose en el ensayo MTT. Para la generación de esferoides tridimensionales, se cultivaron células HepG2 a razón de 20.000 células por pocillo en una placa de fondo redondo y baja fijación. Los esferoides HepG2 se formaron y cambiaron en su morfología el día 5 de cultivo. Una vez formados los esferoides, se trataron con lovastatina y extracto de micelio en diferentes concentraciones durante 48 h. Luego, se investigó la viabilidad de los esferoides utilizando el ensayo azul de Presto. Se investigaron los efectos del tratamiento con extracto de micelio sobre el perfil biológico y la producción de colesterol por parte de los esferoides después de 2 días de incubación.

Se prepararon esferoides HepG2 cultivados en los medios de control, extractos de micelio de G. australe 2,5 mg/ml y lovastatina 5 µM para realizar análisis FTIR. Después de 48 h de incubación, todas las muestras se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS) fría y el sobrenadante se eliminó mediante centrifugación a 230 xg durante 5 minutos (repetido dos veces más) seguido de agua desionizada durante otras 3 repeticiones. El sedimento de esferoides se añadió a 20 μl de agua desionizada y se resuspendió suavemente usando una punta de pipeta antes de depositarlo en una ventana de BaF2 de 22 mm de diámetro x 1,0 mm de espesor (1–2 μl por cada gota) y se secó en un desecador a temperatura ambiente hasta El experimento microespectroscópico FTIR sincrotrón comenzó en el Instituto de Investigación de Luz Sincrotrón en Nakhon Ratchasima, Tailandia, utilizando la unidad de espectroscopia e imágenes infrarrojas BL4.1. El proceso se llevó a cabo utilizando un rango de energía de fotones de 0,01 a 0,5 eV con un objetivo Schwarzschild de 36 × y un espectrómetro Bruker Vertex 70 junto con un microscopio Bruker Hyperion 2000 (Bruker Optics) y un telururo de mercurio-cadmio de banda estrecha de 100 µm. Detector enfriado con nitrógeno líquido. La recopilación de datos espectrales FTIR se controló utilizando el software OPUS 7.8 (Bruker Optics Ltd.). Las muestras se analizaron en el rango espectral infrarrojo de 4000 a 800 cm −1 en modo de transmisión con una apertura cuadrada de 10 × 10 µm. El espectro de cada área de muestra seleccionada se registró con una resolución de 6 cm-1 y representó el promedio de 64 escaneos. Se extrajeron y seleccionaron espectros FTIR apropiados con la intensidad de la banda de amida I en el rango de 0,2 a 1,2 abs de cada imagen de muestra medida utilizando el programa OPUS. Para observar los cambios bioquímicos en los tres grupos de muestras, se utilizó el software Unscrambler X 10.5 (CAMO Analytics) para el análisis de componentes principales (PCA). El preprocesamiento de datos se realizó utilizando la derivada de la transformada de Savitzky‒Golay (orden de derivada: 2, orden polinómico: 3, puntos de suavizado: 17, puntos izquierdos: 8, puntos derechos: 8) y posteriormente se convirtió para las regiones espectrales de 3000–2800 cm- 1 (lípidos) y 1700–1112 cm-1 (proteínas y ácidos nucleicos) según la corrección de señal multiplicativa extendida para PCA adicional. Unscrambler X redujo triplicados de un tercio de los espectros FTIR derivatizados secundarios del tratamiento de datos EMSC de cada grupo de muestra antes de la integración del área del pico mediante el programa OPUS.

La cantidad de colesterol se cuantificó utilizando un kit de ensayo de colesterol HDL y LDL/VLDL (Abcam). Después de 48 h de incubación con lovastatina y el extracto de micelio, los esferoides se recogieron y se lavaron con PBS frío. El colesterol total se extrajo de las muestras añadiendo 100 µl de tampón de ensayo de colesterol y se centrifugó a 4 °C durante 10 minutos a 13.000 xg utilizando una microcentrífuga fría. El sobrenadante se recogió para medir el colesterol total. Para una cuantificación adicional de lipoproteínas de alta densidad (HDL), se mezcló un volumen del sobrenadante con tampón de precipitación 2x ​​y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se recogió HDL del sobrenadante después de centrifugación a 2000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente; este paso se repitió. Se mezclaron cincuenta microlitros de cada muestra, incluidos los estándares de colesterol, con 50 µl de mezcla de reacción de colesterol que contenía tampón, sondas de colesterol, la mezcla de enzimas relevante y esterasa de colesterol. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 60 min protegido de la luz. Los niveles de absorción en tándem de colesterol en las fracciones total y HDL se determinaron a 570 nm. La cantidad de colesterol se calculó a partir de la pendiente de la curva estándar y la fracción de HDL del colesterol total de cada muestra se presentó como porcentaje. Se utilizó ANOVA unidireccional para analizar el efecto del extracto de 2,5 mg/ml en comparación con el control y lovastatina 5 µM.

Para cada ensayo se realizaron tres experimentos independientes de 3 cultivos de micelio diferentes. Los resultados se presentan como la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism. Se probaron diferencias significativas entre muestras en p <0,05, como se indica en cada resultado.

El espécimen de muestra en este estudio estaba en la etapa joven (Fig. 1a) con un píleo de 2 a 2,5 cm de largo, 1,5 a 2,0 cm de ancho y 0,5 cm de espesor. Pileus flabella se formó para subdimidiarse. La superficie del píleo no era lacada, ligeramente blanda en el margen y concéntricamente sulcada en el centro hacia el margen. El color del píleo era amarillo parduzco con blanco en el margen. El contexto estaba compuesto de fibrillas sueltas y gruesas. El tubo medía entre 0,3 y 0,5 cm de largo y era de color marrón. Los estípites eran sésiles y estaban ampliamente adheridos. Había de 3 a 4 poros/mm, de subcirculares a circulares. La superficie de los poros era blanca. El sistema de hifas era trimítico; las hifas generativas tenían entre 1,5 y 2,0 µm de ancho, paredes delgadas, hialinas y se estrechaban en las ramas con conexiones de abrazadera; las hifas de unión tenían entre 1,5 y 2,5 µm de ancho, paredes gruesas y ramificadas; y las hifas esqueléticas tenían entre 3,0 y 4,0 µm de ancho, paredes gruesas y casi sólidas. Las basidiosporas eran en su mayoría elipsoides, de 7,3 a 10 × 4,5 a 8,7 µm de tamaño, de doble pared con una pared interior de color naranja pardusco pero una pared exterior de color marrón oscuro, con un extremo truncado equinulado (Fig. 1b).

Morfología de Ganoderma australe (a) Cuerpo fructífero. (b) Basidiosporas. (c) Micelio en placas de PDA.

Los micelios que crecieron en las placas de PDA eran algodonosos en un anillo concéntrico (Fig. 1c). Los productos de PCR de 634 pb se sometieron a secuenciación taq de código de barras basada en NGS. Con base en el programa BLASTN (NCBI), las secuencias de los fragmentos de PCR tuvieron 99,84% y 99,68% de identidad con las secuencias de Ganoderma australe LC084706.1 y KJ654369, respectivamente. De acuerdo con la morfología de los cuerpos fructíferos, los datos de secuenciación de los micelios identificaron claramente la muestra de hongo como G. australe.

El análisis por HPLC del estándar de lovastatina a diferentes concentraciones reveló un tiempo de retención de 19,0 min y un LOD de 2,152 × 10–5 µM (0,009 ng/ml). Con un rendimiento de extracción de 12,57 ± 2,34%, los tres extractos de micelio cultivados de forma independiente revelaron perfiles cromatográficos similares. Cada extracción mostró un área de pico alta con tiempos de retención en el rango de 4,0 a 5,5 y 7,0 a 9,0 min, que parecían ser los compuestos principales (Fig. 2a), en comparación con el control en blanco (consulte la Fig. S1 complementaria). Se añadió el estándar de lovastatina a los extractos de etanol para investigar la presencia de lovastatina. Al comparar los tiempos de retención de los picos del extracto con el estándar, la Fig. 2b muestra el aumento de la altura del pico en el tiempo de retención exacto de lovastatina a 19,0 min (flecha negra). Potencialmente, la lovastatina fue producida por el micelio de G. australe. Así, la fracción con un tiempo de retención de 19,0 min del extracto crudo se recogió para una mayor investigación utilizando técnicas de espectrometría de masas.

Cromatogramas de HPLC utilizando detección UV a λ 240 nm. (a) Extracto en etanol de diez microgramos/ml con una figura insertada que muestra concentraciones variadas de estándar de lovastatina. (b) Pico de lovastatina 20 µM en extractos de 8 µg/ml. La flecha negra muestra la persistencia en el tiempo de retención de lovastatina a los 19,0 min con un aumento del área del pico en las muestras enriquecidas.

Se utilizó ESI-MS en modo positivo para examinar los espectros de las fracciones recolectadas al mismo tiempo de retención que el estándar de lovastatina. Los patrones calculados identificaron fórmulas químicas que incluyen: (1) C24H36O5 con m/z + 1 en 405,2628 y un error de − 0,8 mDa, (2) C18H39NO3 con m/z + 1 en 318,2991 y un error de − 1,2 mDa, y ( 3) C18H30O2 con m/z + 1 en 279,2304 y un error de 1,5 mDa. Las fórmulas calculadas fueron potencialmente las de lovastatina19, fitoesfingosina20 y ácido linolénico21, respectivamente, para estos componentes de Ganoderma spp. Sin embargo, la intensidad de lovastatina no estaba clara debido al ruido en la fracción espectral. Por lo tanto, la fracción se examinó más a fondo mediante análisis HR-MS en modo MRM para adquirir el patrón espectral de masas que se comparó con el del estándar de lovastatina (Fig. 3a). La fracción contenía 3 picos prominentes en 405,2619, 285,1861 y 199,1483 Da (Fig. 3b) que coincidían con lovastatina. Así, se concluyó que la lovastatina estaba presente en los micelios de G. australe extraídos con etanol, aunque en una cantidad traza de los 3,2 mg de extracto crudo.

Patrones espectrales de masas (MS2). ( a, b ) QTOF en análisis en modo MRM de ( a ) estándar de lovastatina. (b) Fracciones recogidas al mismo tiempo de retención que lovastatina. (c – f) Análisis Obitrap de extracto crudo que potencialmente contiene (c) ácido p-cumárico. (d) Ácido gamma-aminobutírico (GABA). (e) Nicotinamida. (f) Colina. Los marcos negros representan los tres picos superiores que coinciden con los patrones de fragmentación de compuestos provisionales en las bibliotecas.

Además, se investigaron los extractos en etanol de los micelios de G. australe en busca de compuestos bioactivos utilizando metodologías LC-MS/MS. Los resultados proporcionados por LC/MS Orbitrab revelaron el perfil de compuestos bioactivos que tienen total o parcialmente, al menos los 3 picos superiores, coincidentes con patrones de fragmentación de compuestos provisionales en bibliotecas. También se han informado en otros hongos (Tabla 1), incluido un ácido fenólico, un neurotransmisor, una vitamina, aminoácidos, sacáridos, nucleósidos y derivados. Por ejemplo, los patrones espectrales de masas del ácido p-cumárico, GABA, nicotinamida y colina se muestran en las figuras 3c a f, respectivamente. Además, la investigación actual identificó otros derivados de biomoléculas de los que no se encontraron otros informes de estos compuestos en hongos en la literatura (Datos del suplemento).

Se investigaron varias concentraciones del extracto para determinar su efecto inhibidor sobre la actividad de la HMG-CoA reductasa humana (Fig. 4). La cinética enzimática reveló la mayor actividad inhibidora del extracto de 1 mg/ml con un 79,08 ± 1,72 % sobre el control (negativo). Sin embargo, la inhibición se redujo al aumentar la concentración del extracto a 2,0 y 2,5 mg/mL, con porcentajes de inhibición de 71,90 ± 1,03% y 66,11 ± 0,72%, respectivamente. Según el control positivo proporcionado en el kit, la pravastatina 1 µM tuvo una inhibición del 84,32 ± 2,10 %. El análisis estadístico mostró que los extractos de micelio iguales o superiores a 0,50 mg/ml tuvieron efectos inhibidores comparables a los de la pravastatina. La concentración inhibidora media máxima (CI50) del extracto micelial fue de 234,9 ± 1,6 µg/ml. Se pudo concluir que el extracto micelial tuvo actividad inhibidora contra la HMG-CoA reductasa libre de células de manera dependiente de la concentración hasta 1 mg/mL de extracto. Se examinó más a fondo la actividad del extracto sobre la viabilidad celular y la producción de colesterol por las células del hígado.

Inhibición de la actividad de la HMG-CoA reductasa libre de células por el extracto de micelio de G. australe. El extracto de etanol se disolvió en DMSO en un rango de concentración de 0,0125 a 2,5 mg/ml. Se utilizó DMSO como control negativo y pravastatina como control positivo. Las tasas reducidas de NADPH se calcularon a partir de la reducción de la absorbancia espectrofotométrica a 340 nm. Los resultados se presentan como porcentaje del control negativo en ausencia de compuestos. Las barras indican la media ± SEM de experimentos por triplicado. Se realizó ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para comparar con el control de pravastatina. Los valores con letras que no aparecen más de una vez son significativamente diferentes entre sí (p < 0,0001).

Se utilizaron células HepG2 cultivadas en 2-D y 3-D para investigar el efecto de los extractos de micelio sobre la viabilidad celular. Sólo las concentraciones del extracto a 0,08 mg/ml y lovastatina a 2,5 y 5,0 µM no redujeron significativamente la viabilidad de las células HepG2 2-D (Fig. 5a). Por el contrario, la viabilidad celular de los esferoides no se vio afectada significativamente por el extracto en todas las concentraciones preparadas en este experimento ni por la lovastatina a 2,5 y 5 µM (Fig. 5b). Además, las formas de los esferoides tridimensionales de HepG2 eran similares y tenían un tamaño superior a 1 mm para todas las muestras (Fig. 5c). Los resultados mostraron que el extracto de micelio utilizado a 2,5 mg/ml no tuvo toxicidad por esferoides. Así, la concentración máxima de micelio que se pudo preparar en esta investigación se utilizó para examinar el efecto de los esferoides sobre la producción de colesterol.

Viabilidad de las células HepG2 y morfología de sus esferoides. ( a ) Viabilidad de células HepG2 2-D. (b) Esferoides tridimensionales presentados como porcentaje de valores de células/esferoides cultivados con medios de control. Las células y los esferoides se cultivaron con diversas concentraciones del extracto y lovastatina 2,5 y 5 µM durante 48 h. Los resultados se expresan como medias ± SEM de tres extracciones individuales (n = 3), al menos por triplicado para cada ensayo. Las diferencias estadísticas se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los valores con letras que no aparecen más de una vez son significativamente diferentes entre sí (p = 0,0004). (c) Imágenes de esferoides HepG2: cultivadas con control de medios (izquierda), extracto de micelio de 2,5 mg/ml (centro) y lovastatina 5 µM (derecha) durante 48 h tomadas con un microscopio óptico.

Los espectros FTIR 70, 61 y 83 del control, extracto de micelio y tratamiento con lovastatina, respectivamente, se segregaron en un gráfico de puntuación 2-D (Fig. 6a). PC-1 (27%) diferenció el control del tratamiento micelial, pero PC-3 (9%) demostró una diferencia entre el tratamiento con lovastatina y las otras muestras. Se utilizó PCA para revelar la variación en los compuestos bioquímicos (Fig. 6b). Los análisis de PC1 y PC3 revelaron que el control se diferenciaba de los demás por cargas en los picos 2927 y 2855 para lípidos y 1656 y 1627 para amida I, mientras que la lovastatina se separó del micelio por diferentes cantidades de colesterol y ácidos nucleicos en los picos 1380 y 1238 en PC3, respectivamente. Además, se analizaron los espectros de derivados secundarios para identificar la diferenciación de las tres moléculas bioquímicas principales de proteínas y ácidos nucleicos (Fig. 6c) y lípidos (Fig. 6d).

Espectros FTIR de esferoides HepG2. (a) Gráfico de puntuación de PC1 y PC3. (b) Gráficos de carga de PCA en el rango espectral de 1000 a 3000 cm-1. (c) Espectros de segunda derivada de regiones de proteínas y ácidos nucleicos en 1000-1700 cm-1. (d) Regiones lipídicas en 2800–3000 cm-1. (e) Área de pico de los espectros secundarios. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para analizar diferentes grupos funcionales de cada muestra por triplicado. Los valores con letras que no aparecen más de una vez son significativamente diferentes entre sí (p < 0,0001). Los esferoides tratados con medios de control, 2,5 mg/ml de extracto de micelio y 5 µM de lovastatina durante 48 h se presentan en azul, verde y rojo, respectivamente.

Los promedios de los espectros de la segunda derivada en regiones de ácido nucleico (1500–1000 cm-1) se muestran en la Fig. 6c. Las tres muestras diferentes tenían bandas de absorción con números de onda similares de 1462, 1388, 1235 y 1167 cm-1 pero con diferentes intensidades. La región proteica (1700–1500 cm−1) presentó absorciones importantes en 1743, 1653, 1633, 1543 y 1516 cm−1 (Fig. 6c). La mayoría de estos números de onda corresponden a la vibración de grupos funcionales reportados en células HepG2 bidimensionales y tejido humano tridimensional. El número de onda de 1235 cm-1 mostró la vibración asimétrica de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos22,23. Los resultados mostraron que el micelio, el control y la lovastatina tenían intensidades que variaban de alta a baja. El número de onda 1743 cm-1, que era el estiramiento de C=O en proteínas24 y lípidos22,25, tuvo una intensidad similar en el tratamiento micelial al tratamiento con lovastatina, pero fue mayor que para el control. El número de onda 1653 cm-1 representó el estiramiento de la región de amida I de la hélice α22,26, mientras que 1633 cm-1 mostró la vibración de la región de amida I de las láminas β en HepG222 y tejido 2-D. Los cambios espectrales de los dos últimos números de onda en el estudio actual indicaron que tanto los esferoides tratados con micelio como con lovastatina tenían reducciones en la proteína en la estructura de hélice α, pero el cambio conformacional en las láminas β ocurrió solo en las muestras tratadas con medicamentos. Las tres muestras de esferoides tenían aproximadamente la misma intensidad a 1543 cm-1, que era la vibración de la amida II28,29.

La región espectral de lípidos a aproximadamente 3000-2800 cm-1 demostró vibraciones del grupo C-H. El promedio espectral de las tres muestras mostró picos de absorbancia altos a 2925 y 2852 cm-1 (Fig. 6d). El número de onda en 2925 cm-1 se refería a una vibración asimétrica del CH2 en los lípidos25,30; 2852 cm-1 fue la vibración de estiramiento simétrica de CH225,27 observada tanto en HepG2 2-D como en tejido humano. Los esferoides tratados con micelio de G. australe tuvieron picos de intensidad más altos a 2852 y 2925 cm-1 que las muestras de control y lovastatina, lo que sugiere una proporción relativamente alta de lípidos.

La Figura 6e muestra el área del pico de los espectros secundarios de cada muestra que tenía asignaciones de bandas para estiramiento de CH2 asimétrico y simétrico (2936–2912 y 2863–2842, respectivamente), grupos carbonilo (1754–1733), amida I (1670–1619). , estiramiento simétrico de colesterol CH2 y CH3 (1469-1438) y flexión (1404-1368) 31,32, así como grupos de estiramiento asimétrico de fosfato en ADN y ARN (1255-1208). El análisis reveló que sólo el estiramiento asimétrico de CH2 del extracto de micelio fue significativamente mayor que el del control. Hubo una tendencia a que el estiramiento simétrico de CH2 del extracto de micelio y el estiramiento de colesterol del tratamiento con lovastatina fueran mayores que los de las otras muestras. Debido a que el colesterol es un tipo de lípido y el producto de la vía del mevalonato, tanto él como su subtipo, HDL, se cuantificaron aún más.

Las células del hígado se cultivaron en forma esferoidal tridimensional. Después de 48 h de incubación con 2,5 mg/mL de extracto y 5 µM de lovastatina, se desesterificó el colesterol producido por los esferoides y se midió la cantidad de colesterol total. Luego, el HDL se separó del colesterol total en todas las muestras, en función de su densidad antes de ser cuantificado. El contenido de HDL se calculó utilizando la curva estándar y se presentó como porcentaje del colesterol total para muestras individuales. Los esferoides tratados con 2,5 mg/mL de extracto de micelio durante 48 h aumentaron significativamente el porcentaje de HDL a 71,35 ± 2,74 % en comparación con el control (33,26 ± 3,15 %), como se muestra en la Fig. 7. Sorprendentemente, no solo cambió la lovastatina 5 µM. el porcentaje de HDL del colesterol total durante la incubación alcanzó un porcentaje de HDL de 32,13 ± 3,24%, pero también aumentó la cantidad de colesterol total a 6,11 ± 0,50 µg. Sin embargo, la cantidad total de colesterol en el extracto micelial y el control fue aproximadamente la misma (3,32 ± 0,47 µg y 3,25 ± 0,93 µg, respectivamente). En consecuencia, los resultados indicaron el efecto de la extracción de micelio en el aumento de la producción de HDL en modelos tridimensionales de células hepáticas.

Producción de colesterol por esferoides HepG2. Se cultivaron células tridimensionales con medio de control, 2,5 mg/ml de extracto de micelio y 5 µM de lovastatina durante 48 h. El contenido de HDL se presenta como el porcentaje del colesterol total de cada muestra individual. Las barras indican el porcentaje medio ± SEM de cada muestra. Se investigaron por triplicado tres micelios cultivados individualmente. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los valores con letras que no aparecen más de una vez son significativamente diferentes entre sí (p = 0,0004).

Nuestra identificación morfológica mostró que la mayoría de las características del espécimen eran similares a las de G. australe, como lo describen Luangharn et al.15, excepto por el color verde pálido de la superficie de los poros que, en cambio, concordaba con el cuerpo fructífero joven descrito por Yamashi. y Hirose33. Bellemain et al.34 informaron que la secuencia obtenida de micelio que cubre la región de secuencia ITS1-5.8S-ITS2 es potencialmente un código de barras de ADN fúngico. Por tanto, la secuencia de este espécimen se puede utilizar claramente para la identificación de hongos. Mostró una alta similitud con G. australe (> 99%) obtenida de países del sudeste asiático, incluidos Malasia (LC084706.1)33 e Indonesia (KJ654369). Por lo tanto, la muestra de hongo se identificó como G. australe basándose en características morfológicas e identificación molecular.

Ganoderma australe pertenece al género Ganoderma, el cual ha sido ampliamente reportado por sus funciones medicinales y la producción de lovastatina por el micelio de G. lucidum, el cual fue extraído con etanol19, similar al trabajo actual. La identificación de lovastatina en el extracto micelial de G. australe se realizó inicialmente comparando los tiempos de retención de los picos de la muestra con el compuesto estándar. El área del pico del extracto crudo fue mayor que el LOD de la técnica, lo que llevó al método de adición en el que las soluciones estándar de lovastatina se agregaron a la muestra como estándares internos. La posible presencia de lovastatina en la muestra se mostró como un aumento en la altura del pico durante el tiempo de retención adecuado. Por lo tanto, se realizó más análisis de masas.

Los patrones espectrales de masas en tándem de la fracción establecieron originalmente la presencia de lovastatina en los micelios de G. australe extraídos con etanol, a pesar de contener trazas de este compuesto. Se podrían utilizar diferentes partes del hongo (como los cuerpos fructíferos) y diferentes sustratos o métodos de fermentación para aumentar la cantidad de lovastatina producida35.

También se examinaron los perfiles de biocomponentes del micelio de G. australe. La mayoría de los compuestos identificados tienen efectos farmacéuticos y se encuentran en los hongos. Por ejemplo, los polisacáridos están presentes en Garnoderma spp., con amplios informes sobre sus actividades biológicas, como actividades antioxidantes, antitumorales y antimicrobianas36. Sin embargo, sólo se encontraron tentativamente monómeros y disacáridos en el extracto del estudio actual, tal vez porque en este protocolo se utilizó menos solvente hidrófilo para extraer los ingredientes bioactivos. Además, los nucleósidos desempeñan un papel en el mantenimiento de la respuesta inmune y están presentes en los hongos37,38. Los perfiles de biocomponentes actuales revelaron muchos nucleósidos y sus derivados. Los ácidos palmítico (C16), linoleico (C18) y oleico (C18) son los principales ácidos grasos presentes en la extracción con petróleo de los cuerpos fructíferos de G. australe39. En el estudio actual, se informó que solo el ácido linolénico (C18), un lípido omega-3, estaba potencialmente presente en el micelio de G. australe, tal vez porque se aplicó un solvente polar durante la extracción. La presencia de estos compuestos debería investigarse más a fondo en comparación con sus estándares. Además, recientemente se han descubierto alcaloides40 y meroterpenoides41 en los cuerpos fructíferos de G. australe extraídos con un compuesto orgánico diferente (acetato de etilo). La nicotinamida, el GABA y la colina son componentes bioesenciales en los humanos y potencialmente se encuentran en el micelio de G. australe, como se informa en el trabajo actual. Además, el ácido p-cumárico se utiliza como suplemento para aliviar la hiperlipidemia42,43 y también se encontró en el trabajo actual. Por tanto, es un contribuyente potencial a las funciones medicinales del micelio de G. australe.

Los triterpenoides son uno de los compuestos más estudiados contenidos en Garnoderma spp. Recientemente, se han identificado muchos triterpenoides nuevos de tipo lanostano en extractos de micelios44 y cuerpos fructíferos de G. australe45,46,47 utilizando alcohol y acetato de etilo. Algunos de estos compuestos han demostrado actividad antituberculosa, inhibición moderada de la producción de óxido nítrico y un efecto inhibidor significativo sobre la actividad de la α-glucosidasa. Además, un metabolito triterpenoide, el ácido 7-oxoganodérico Z (C30H46O4), tiene un efecto inhibidor sobre la HMG-CoA reductasa48, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de novo del colesterol. El compuesto puro extraído de los cuerpos fructíferos de G. lucidum con etanol al 95% tenía un valor de CI50 de 22,3 µM. Esto lleva a la hipótesis de que el extracto micelial de G. australe podría tener actividad inhibidora contra la HMG-CoA reductasa.

El colesterol humano se sintetiza principalmente a diario en el hígado49 y se controla mediante inhibición por retroalimentación en el paso limitante de la velocidad de la vía catalizada por la HGM-CoA reductasa. Por lo tanto, cualquier compuesto que tenga un efecto inhibidor sobre la actividad de la HMG-CoA reductasa es de interés para su uso en el tratamiento de la hipercolesterolemia. En consecuencia, en el presente estudio se observó el efecto del extracto de micelio sobre la inhibición de la enzima humana in vitro, la viabilidad de las células hepáticas y la producción de colesterol por las células hepáticas tridimensionales. El resultado del ensayo in vitro de HGM-CoA reductasa demostró que el extracto micelial de G. australe a 0,5 mg/mL (50 µg en una reacción) mostró una inhibición del 58,69%, que fue mayor que el efecto inhibidor de 23 plantas medicinales en la misma cantidad. en la reacción in vitro50.

Hay compuestos bioactivos presentes en Ganoderma spp. que tienen un efecto inhibidor sobre la HMG-CoA reductasa, como la lovastatina19, los triterpenos de lanostano51 y el 7-oxoganodérico Z48. Aunque se han identificado lanostanos en los micelios44 y cuerpos fructíferos45 de G. australe, ninguno de estos trabajos ha investigado la actividad inhibidora de G. australe sobre la enzima. El estudio actual demostró la inhibición de la HMG-CoA reductasa libre de células de manera dependiente de la concentración mediante el extracto de micelio de G. australe. A pesar de presentar una inhibición máxima a 1 mg/mL, la concentración del extracto crudo a 2 y 2,5 mg/mL mostró una inhibición ligeramente disminuida que podría haber sido resultado de la dispersión de la luz por las partículas y la disminución del valor de absorción a 340 nm. La presencia de lovastatina y ácido p-cumárico provisional (demostrado mediante LC‒MS) sugirió tal efecto inhibidor sobre la enzima limitante de la tasa de colesterol por parte del extracto micelial.

El efecto del extracto de micelio de G. australe sobre la viabilidad de HepG2 2-D y 3-D se observó antes de las investigaciones de los perfiles bioquímicos y la producción de colesterol. Aunque 2,5 mg/mL del extracto redujeron la proliferación de la monocapa HepG2, esta concentración no afectó la proliferación de las células en forma tridimensional, quizás debido a la absorción diferencial de los biocomponentes por diferentes modelos celulares; por lo tanto, se utilizó la concentración máxima para análisis posteriores. Los esferoides HepG2 reflejaron la forma tridimensional del hígado y las funciones fisiológicas mejor que los del cultivo en monocapa. Esas funciones incluyen la desintoxicación52, la producción de colesterol53 y la producción de apolipoproteínas (apoE y apoA-I)54. Los resultados sugirieron el uso potencial del extracto micelial de G. australe para examinar la producción de colesterol utilizando un modelo de hígado tridimensional.

El análisis FTIR proporcionó información a nivel molecular utilizando espectros de vibración específicos de los grupos funcionales y tipos de enlace de una molécula. Los esferoides HepG2 se investigaron originalmente utilizando FTIR en el trabajo actual. La mayoría de los espectros obtenidos tenían aproximadamente los mismos números de onda que para HepG222,25,28 en 2-D y los tejidos humanos que representan un entorno tridimensional similar a este modelo esferoide26,27,29,30. El cambio conformacional en las proteínas de hélice α a láminas β que se produjo en el tratamiento con lovastatina también se observó en células HepG2 tratadas con pravastatina, que es una estatina natural químicamente modificada22. En la región de ácido nucleico de cada muestra, números de onda similares pero diferentes intensidades de pico indicaron los mismos componentes a pesar de las diferentes concentraciones de ácidos nucleicos. La viabilidad de los esferoides tratados sugirió que era poco probable que tal efecto se debiera a la proliferación del ADN en condiciones de laboratorio. Por lo tanto, potencialmente se produjo una expresión genética alterada.

En general, la espectroscopia FTIR se puede utilizar para diferenciar los perfiles lipídicos de los esferoides de G. australe tratados. Se demostró que el extracto de micelio aumentó la cantidad de lípidos producidos por los esferoides HepG2, en comparación con el control y la lovastatina. Además de los ácidos grasos y los fosfolípidos (un componente de la membrana celular), el colesterol es un tipo de lípido producido principalmente por los hepatocitos. Así, se evaluaron las vibraciones de los grupos funcionales del colesterol. LDL y HDL sin reactivos tienen bandas de huellas dactilares a 2852 y 2926 cm-1, respectivamente, para la vibración de CH de lípidos, similar al informe actual. A pesar de estar en la región proteica, los picos en 1735 y 1739 cm-1 se asociaron con la vibración de C=O encontrada en LDL y HDL sin reactivos, respectivamente55. Esos picos estaban en 1743 cm-1 en el trabajo actual pero no pudieron usarse para diferenciar la vibración del éster de LDL, HDL o proteína. Los números de onda desplazados podrían deberse a los diferentes métodos de preparación del tejido56 y a la dimensión de las muestras (por ejemplo, 2-D o 3-D de las células de melanoma)57.

En los experimentos actuales, los micelios aumentaron significativamente el porcentaje de HDL manteniendo el contenido de colesterol total en comparación con el control. En este estudio se observó una mayor cantidad de colesterol total producido por la incubación de lovastatina, similar a la tendencia observada de aumento del área del pico alrededor del estiramiento del colesterol en el resultado FTIR. Esto podría deberse al efecto de recuperación homeostática posterior al efecto inhibidor de la lovastatina, porque la actividad de la HMG-CoA reductasa está controlada por la inhibición por retroalimentación58. De manera comparable, el contenido de colesterol aumentó cuando los esferoides HepG2 se incubaron con lovastatina 1 µM durante más de 22 h; sin embargo, se observó una cantidad reducida de colesterol cuando los esferoides fueron tratados durante un período más corto (4 h) con lovastatina 10 μM59.

El HDL se ha convertido en el colesterol de interés por su función en el transporte inverso del colesterol y su beneficio para la protección cardiovascular60. En tales circunstancias, la mezcla de compuestos naturales en el extracto micelial de G. australe aumentó la producción de HDL por parte de los esferoides tratados; En particular, esto fue más eficaz que la lovastatina pura. Se deben realizar más experimentos para determinar si este resultado se corresponde con una expresión genética diferente y una producción de proteínas de apoproteínas compuestas diferencialmente de HDL y otros colesteroles. Por ejemplo, se deben considerar la apoE y la apoA-I (una apoproteína constituyente de HDL), que se expresan altamente en el modelo esferoide54.

Aunque se sabe que los modelos tridimensionales superan el inconveniente del cultivo celular en monocapa para imitar la función del tejido, estudios adicionales del modelo in vivo deberían investigar el tratamiento potencial de la hipercolesterolemia mediante alimentos funcionales. Por ejemplo, se mezclaron extracto de micelio hidroalcohólico61 y extracto de fase orgánica62 de G. lucidum con alimentos para tratar ratones con dieta alta en grasas en una dosis de 0,5 a 1,0% y hámsteres en una dosis de 2,5 a 5,0%, respectivamente. El trabajo actual utilizó 2,5 mg/ml, comparable al 0,25 %, del extracto de micelio para tratar los esferoides HepG2, lo que indica una dosis segura para futuros experimentos en modelos animales. Además, el tratamiento con ácido p-cumárico, un compuesto provisional encontrado en el micelio de G. australe en el presente trabajo, alivió el efecto del hipercolesterol in vivo42,43.

En conclusión, se demostraron por primera vez los biocomponentes del extracto micelial de G. australe. El extracto tuvo un efecto inhibidor sobre la actividad de una enzima limitante de la tasa de colesterol humano, potencialmente aportada por la lovastatina y el ácido p-cumárico en el extracto micelial. Los perfiles bioquímicos de las células hepáticas tridimensionales cambiaron cuando se trataron con lovastatina y el extracto de micelio. Los esferoides tratados con el micelio exhibieron un perfil lipídico distintivo. Además, el porcentaje de HDL en el colesterol total aumentó en comparación con el control y la lovastatina pura, lo que implica un efecto beneficioso y sugiere un tratamiento potencial para la hipercolesterolemia utilizando mezclas de compuestos naturales de micelio de G. australe recolectados en Tailandia.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de esta investigación están disponibles en este artículo.

Nelson, RH Hiperlipidemia como factor de riesgo de enfermedad cardiovascular. Remilgado. Clínica de atención. Apagado. Practica. 40, 195–211. https://doi.org/10.1016/j.pop.2012.11.003 (2013).

Artículo de Google Scholar

Pirillo, A., Casula, M., Olmastroni, E., Norata, GD & Catapano, AL Epidemiología global de las dislipidemias. Nat. Rev. P. Cardiol. 18, 689–700. https://doi.org/10.1038/s41569-021-00541-4 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chester, A. y El Guindy, A. De flamenco a endo: el descubrimiento de las estatinas. Globo. Cardiol. Ciencia. Practica. 2021, e202132. https://doi.org/10.21542/gcsp.2021.32 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ward, NC, Watts, GF y Eckel, RH Toxicidad de las estatinas. Circo. Res. 124, 328–350. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.118.312782 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Poli, A. et al. Nutracéuticos y alimentos funcionales para el control de los niveles de colesterol plasmático. Un documento de posición intersociedad. Farmacéutico. Res. 134, 51–60. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2018.05.015 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Reis, FS, Martins, A., Vasconcelos, MH, Morales, P. & Ferreira, ICFR Alimentos funcionales a base de extractos o compuestos derivados de hongos. Tendencias Ciencia de los alimentos. Tecnología. 66, 48–62. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2017.05.010 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Krittanawong, C. y col. Consumo de hongos y salud cardiovascular: una revisión sistemática. Soy. J. Med. 134, 637-642.e632. https://doi.org/10.1016/j.amjmed.2020.10.035 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wachtel-Galor, S., Yuen, J., Buswell, JA y Benzie, IFF Medicina herbaria: aspectos biomoleculares y clínicos (eds Benzie, IFF y Wachtel-Galor, S.) (2011).

Kladar, NV, Gavarić, NS y Božin, BN Conocimientos de Ganoderma sobre los efectos anticancerígenos. EUR. J. Cáncer Anterior. 25, 462–471 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Winska, K., Maczka, W., Gabryelska, K. & Grabarczyk, M. Hongos del género ganoderma utilizados para tratar la diabetes y la resistencia a la insulina. Moléculas https://doi.org/10.3390/molecules24224075 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, Y., Xu, X., Liu, S., Huang, L. y Gu, J. Ganoderma: una revisión de la inmunoterapia contra el cáncer. Frente. Farmacéutico. 9, 1217. https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01217 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, SW, Tomlinson, B., Chan, P. & Lam, CWK Los efectos beneficiosos del Ganoderma lucidum sobre el riesgo de enfermedades cardiovasculares y metabólicas. Farmacéutica. Biol. 59, 1161-1171. https://doi.org/10.1080/13880209.2021.1969413 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Baby, S., Johnson, AJ y Govindan, B. Metabolitos secundarios de Ganoderma. Fitoquímica 114, 66-101. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2015.03.010 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hyde, KD y cols. La asombrosa diversidad de Tailandia: hasta el 96% de los hongos del norte de Tailandia pueden ser nuevos. Buzos de hongos. 93, 215–239 ​​(2018).

Artículo de Google Scholar

Luangharn, T. y col. Especies de Ganoderma (Ganodermataceae, Basidiomycota) de la subregión del Gran Mekong. J. Hongos 7, 819 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Jannual, N., Nipitwattanaphon, M., Hasin, S. & Kaewgrajang, T. Caracterización morfológica y molecular de Termitomyces (Lyophyllaceae, Agaricales) en Tailandia. Biodiversores. J. Biol. Diversos. 21, 2481–2491. https://doi.org/10.13057/biodiv/d210620 (2020).

Artículo de Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW y Lipman, DJ Herramienta básica de búsqueda de alineación local. J. Mol. Biol. 215, 403–410. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Paemanee, A. y col. La espectrometría de masas y la microespectroscopia sincrotrón-FTIR revelan la actividad antiinflamatoria de los extractos de Bua Bok. Fitoquímica. Anal. 33, 1086-1098. https://doi.org/10.1002/pca.3161 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lo, YC et al. Estudio comparativo del contenido de varios componentes bioactivos en cuerpos fructíferos y micelios de hongos culinarios-medicinales. En t. J. Med. Hongos 14, 357–363. https://doi.org/10.1615/intjmedmushr.v14.i4.30 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, L. y col. Actividad antioxidante, hipoglucemiante y protectora de la lesión hepática aguda del extracto acuoso de esporas de Ganoderma lucidum. J. Función. Alimentos 97, 105254. https://doi.org/10.1016/j.jff.2022.105254 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Saadoon, HF, Khorsheed, AC y Abdul-Hadi, SY Análisis de muchos ácidos grasos y aceites volátiles en algunas Ganoderma spp. utilizando la técnica de cromatografía gas-líquido. Conferencia de la PIO. Ser. Entorno terrestre. Ciencia. 761, 012050 (2021).

Artículo de Google Scholar

Ressaissi, A., Pacheco, R. & Serralheiro, MLM Cambios a nivel molecular inducidos por derivados del ácido hidroxicinámico en la línea celular HepG2: comparación con pravastatina. Ciencias de la vida. 283, 119846. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119846 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fukuyama, Y., Yoshida, S.-H., Yanagisawa, S. y Shimizu, M. Un estudio sobre las diferencias entre los carcinomas orales de células escamosas y las mucosas orales normales medidas mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier. Bioespectroscopia 5(2), 117–126 (1999).

3.0.CO;2-K" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291520-6343%281999%295%3A2%3C117%3A%3AAID-BSPY5%3E3.0.CO%3B2-K" aria-label="Article reference 23" data-doi="10.1002/(SICI)1520-6343(1999)5:23.0.CO;2-K">Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ahmed, IA y Gai, F. Método sencillo para introducir una sonda infrarroja de éster en proteínas. Ciencia de las proteínas. 26, 375–381. https://doi.org/10.1002/pro.3076 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khalifa, O. y col. Investigación del efecto de la exendina-4 sobre la esteatosis inducida por ácido oleico en células HepG2 mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier. Biomedicinas. https://doi.org/10.3390/biomedicines10102652 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Paluszkiewicz, C. & Kwiatek, WM Análisis de tejidos de próstata cancerosos humanos mediante microespectroscopia FTIR y técnicas SRIXE. J. Mol. Estructura. 565–566, 329–334. https://doi.org/10.1016/S0022-2860(01)00527-0 (2001).

ADS del artículo Google Scholar

Fabián, H. et al. Un estudio espectroscópico infrarrojo comparativo de tumores de mama humanos y xenoinjertos de células tumorales de mama. Bioespectroscopia 1, 37–45. https://doi.org/10.1002/bspy.350010106 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Junhom, C., Weerapreeyakul, N., Tanthanuch, W. y Thumanu, K. La microespectroscopia FTIR define las células tempranas del carcinoma hepatocelular humano (HepG2) resistentes a los medicamentos. Exp. Resolución celular. 340, 71–80. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2015.12.007 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Richter, T. y col. Identificación de tejido tumoral mediante espectroscopia FTIR en combinación con tomografía por emisión de positrones. Vibración. Espectrosc. 28, 103-110. https://doi.org/10.1016/S0924-2031(01)00149-7 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Wu, JG y cols. Distinguir tejidos bucales malignos de normales mediante técnicas de fibra óptica FTIR. Biopolímeros 62, 185-192 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gupta, U., Singh, VK, Kumar, V. y Khajuria, Y. Estudios espectroscópicos del colesterol: transformada de Fourier, análisis de frecuencia vibratoria e infrarroja. Madre. Enfoque 3, 211–217. https://doi.org/10.1166/mat.2014.1161 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Vyas, PM y Joshi, M. Estudios dieléctricos y microtopográficos de superficie de cristales de colesterol. Adv. Madre. Res. 665, 289–296. https://doi.org/10.4028/www.scientific.net/AMR.665.289 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Yamashita, S. & Hirose, D. Análisis filogenético del complejo Ganoderma australe en una selva tropical de Borneo e implicaciones para el mecanismo de coexistencia de varios tipos filogenéticos. Ecología de hongos. 24, 1–6. https://doi.org/10.1016/j.funeco.2016.04.006 (2016).

Artículo de Google Scholar

Bellemain, E. y col. ITS como código de barras de ADN ambiental para hongos: un enfoque in silico revela posibles sesgos de la PCR. BMC Microbiol. 10, 189. https://doi.org/10.1186/1471-2180-10-189 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barrios-Gonzalez, J., Perez-Sanchez, A. & Bibian, ME Nuevos conocimientos sobre la biosíntesis de lovastatina y su producción por fermentación de Aspergillus terreus. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 104, 8979–8998. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10871-x (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ferreira, SCIIF et al. Características químicas de los polisacáridos de Ganoderma con actividades antioxidantes, antitumorales y antimicrobianas. Fitoquímica 114, 38–55. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2014.10.011 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Phan, CW y cols. Una revisión sobre los constituyentes de los ácidos nucleicos de los hongos: nucleobases, nucleósidos y nucleótidos. Crítico. Rev. Biotecnología. 38, 762–777. https://doi.org/10.1080/07388551.2017.1399102 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yamamoto, S., Wang, MF, Adjei, AA y Ameho, CK Papel de los nucleósidos y nucleótidos en el sistema inmunológico, la reparación intestinal después de una lesión y la función cerebral. Nutrición 13, 372–374. https://doi.org/10.1016/s0899-9007(96)00376-0 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Martínez, AT, Barrasa, JM, Prieto, A. & Blanco, MN Composición de ácidos grasos y estado taxonómico de Ganoderma australe del sur de Chile. Micol. Res. 95, 782–784. https://doi.org/10.1016/S0953-7562(09)80038-5 (1991).

Artículo de Google Scholar

Zhang, JJ, Dong, Y., Qin, FY, Yan, YM & Cheng, YX Meroterpenoides y alcaloides de Ganoderma australe. Nat. Pinchar. Res. 35, 3226–3232. https://doi.org/10.1080/14786419.2019.1693565 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, JJ, Dong, Y., Qin, FY & Cheng, YX Australeols AF, meroterpenoides neuroprotectores de Ganoderma australe. Fitoterapia 134, 250–255. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2019.02.021 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shen, Y. et al. Efectos protectores del ácido p-cumárico contra oxidantes e hiperlipidemia: una evaluación in vitro e in vivo. Biomédica. Farmacóter. 111, 579–587. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.12.074 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yoon, DS, Cho, SY, Yoon, HJ, Kim, SR y Jung, UJ Efectos protectores del ácido p-cumárico contra la desregulación metabólica inducida por una dieta alta en grasas en ratones. Biomédica. Farmacóter. 142, 111969. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111969 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Isaka, M. y col. Actividad antituberculosa de los lanostanoides de Ganoderma asociados al micelio. J. Nat. Pinchar. 80, 1361-1369. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.6b00973 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Guo, JC y cols. Triterpenoides y meroterpenoides con actividades inhibidoras de la alfa-glucosidasa de los cuerpos fructíferos de Ganoderma australe. Bioorg. Química. 117, 105448. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105448 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Isaka, M. y col. Triterpenoides de lanostano de cuerpos fructíferos cultivados del basidiomiceto Ganoderma australe. Nat. Pinchar. Res. 32, 1044-1049. https://doi.org/10.1080/14786419.2017.1378208 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhou, L., Akbar, S., Wang, MX, Chen, HP y Liu, JK Triterpenos tetra, penta y hexa-nor-lanostano del hongo medicinal Ganoderma australe. Nat. Pinchar. Bioprospectiva. 12, 32. https://doi.org/10.1007/s13659-022-00356-x (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, C., Li, Y. & Sun, HH Nuevos ácidos ganodéricos, metabolitos triterpenoides bioactivos del hongo Ganoderma lucidum. Nat. Pinchar. Res. 20, 985–991. https://doi.org/10.1080/14786410600921466 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Russell, DW Biosíntesis y metabolismo del colesterol. Cardiovascular. Drogas allí. 6, 103–110. https://doi.org/10.1007/BF00054556 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Baskaran, G. y col. Actividad inhibidora de la HMG-CoA reductasa e investigación de fitocomponentes del extracto de hoja de Basella alba como tratamiento para la hipercolesterolemia. Desdrogas. Desarrollo. El r. 9, 509–517. https://doi.org/10.2147/DDDT.S75056 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, K. y col. Triterpenos de lanostano del hongo medicinal tibetano Ganoderma leucocontextum y sus efectos inhibidores sobre la HMG-CoA reductasa y la alfa-glucosidasa. J. Nat. Pinchar. 78, 1977–1989. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.5b00331 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Khalil, M. y col. Las líneas celulares de hepatocitos humanos que proliferan como colonias de esferoides cohesivas en alginato regulan notablemente la función hepática tanto sintética como desintoxicante. J. Hepatol. 34, 68–77 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Damelin, LH y cols. La función mitocondrial alterada y la síntesis de colesterol influyen en la síntesis de proteínas en cultivos extendidos de esferoides HepG2. Arco. Bioquímica. Biofísica. 432, 167–177. https://doi.org/10.1016/j.abb.2004.09.023 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kurano, M. y col. El agonista de LXR aumenta la secreción de apoE del esferoide HepG2, junto con una mayor producción de VLDL y HDL grandes ricas en apoE. Enfermedades de salud de lípidos. 10, 134. https://doi.org/10.1186/1476-511X-10-134 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, KZ, Shaw, RA, Man, A., Dembinski, TC & Mantsch, HH Determinación simultánea y sin reactivos del colesterol sérico en HDL y LDL mediante espectroscopia infrarroja. Clínico. Química. 48, 499–506 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zohdi, V. y col. Importancia de los métodos de preparación de tejidos en el análisis microespectroscópico FTIR de tejidos biológicos: “Trampas para nuevos usuarios”. MÁS UNO 10, e0116491. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116491 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Srisongkram, T., Weerapreeyakul, N. y Thumanu, K. Evaluación del crecimiento celular de melanoma (SK-MEL-2) entre cultivos celulares tridimensionales (3D) y bidimensionales (2D) con microespectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) . En t. J. Mol. Ciencia. https://doi.org/10.3390/ijms21114141 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

DeBose-Boyd, RA Regulación por retroalimentación de la síntesis de colesterol: ubiquitinación acelerada por esteroles y degradación de la HMG CoA reductasa. Resolución celular. 18, 609–621. https://doi.org/10.1038/cr.2008.61 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wrzesinski, K. y col. Los esferoides 3D HepG2/C3A exhiben una funcionalidad fisiológica estable durante al menos 24 días después de recuperarse de la tripsinización. Toxico. Res. 2, 163–172. https://doi.org/10.1039/c3tx20086h (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Ouimet, M., Barrett, TJ & Fisher, EA HDL y transporte inverso de colesterol. Circo. Res. 124, 1505-1518. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.119.312617 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meneses, ME et al. Propiedades hipocolesterolémicas y efectos prebióticos del Ganoderma lucidum mexicano en ratones C57BL/6. MÁS UNO 20, e0159631 (2016).

Artículo de Google Scholar

Berger, A. et al. Propiedades reductoras del colesterol del Ganoderma lucidum in vitro, ex vivo y en hámsteres y minicerdos. Enfermedades de salud de lípidos. 18, 1-12 (2004).

Google Académico

Descargar referencias

Este proyecto de investigación fue apoyado financieramente por la Agencia de Desarrollo de Investigación Agrícola (Organización Pública) de Tailandia (ARDA); International SciKU Branding (ISB), Facultad de Ciencias, Universidad Kasetsart, Tailandia; la Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Investigación e Innovación; y la Investigación Científica e Innovación de Tailandia a través del Programa de Reinvención Universitaria 2021 de la Universidad de Kasetsart. Nos gustaría agradecer al Sr. Anucha Tara, Jefe de la Estación de Investigación y Capacitación en Agroforestería de Trat por facilitar la recolección de muestras.

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad Kasetsart, Bangkok, 10900, Tailandia

Sudthirak Wongkhieo, Wanthongchai Tangmesupphaisan, Jeeraprapa Siriwaseree, Kiattawee Choowongkomon y Napachanok M. Swainson

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Kasetsart, Bangkok, 10900, Tailandia

Yaovapa Aramsirirujiwet y Prissana Wiriyajitsomboon

Departamento de Biología Forestal, Facultad de Silvicultura, Universidad Kasetsart, 50 Ngamwongwan Rd, Lat Yao, Chatuchak, Bangkok, 10900, Tailandia

Tharnrat Kaewgrajang

Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC), Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología (NSTDA), Pathum Thani, 12120, Tailandia

Saifa Pumlofa y Atchara Paemanee

Departamento de Instalaciones de Investigación, Instituto de Investigación de Luz Sincrotrón (Organización Pública), 111 University Avenue, Distrito de Muang, Nakhon Ratchasima, 30000, Tailandia

Buabarn Kuaprasert

Centro de Ciencias del Corazón, Instituto Magdi Yacoub, Harefield, Reino Unido

Adrián Chester

Instituto Nacional del Corazón y los Pulmones (NHLI), Imperial College London, Londres, Reino Unido

Adrián Chester

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

SW fue responsable del modelo y ensayo de células hepáticas. WT preparó el extracto, realizó HPLC y ensayo sin células. TK recopiló e identificó la morfología del hongo silvestre G. australe. YA y PW cultivaron los micelios. TK y NMS analizaron especies de las muestras recolectadas. SP, AP y NMS realizaron HRMS y analizaron compuestos bioquímicos. JS, NMS y BK realizaron análisis FTIR. KW y AHC proporcionaron conocimientos teóricos y diseñaron y corrigieron el artículo. NMS diseñó experimentos, analizó datos y escribió el artículo. Todos los autores contribuyeron a la forma final de este manuscrito.

Correspondencia a Napachanok M. Swainson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wongkhieo, S., Tangmesupphaisan, W., Siriwaseree, J. et al. Actividad reductora del colesterol in vitro del micelio de Ganoderma australe basada en espectrometría de masas, análisis infrarrojo con transformada de Fourier sincrotrón y bioactividad de esferoides hepáticos. Informe científico 13, 13619 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40861-8

Descargar cita

Recibido: 17 de enero de 2023

Aceptado: 17 de agosto de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40861-8

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.