Optimización estadística de P(3HB

Oct 09, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 9005 (2023) Citar este artículo

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El poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) [P(3HB-co-3HHx)] es un copolímero bacteriano de la familia de los polihidroxialcanoatos (PHA), un bioplástico de próxima generación. Nuestro equipo de investigación diseñó recientemente una nueva cepa bacteriana productora de P (3HB-co-3HHx), Cupriavidus necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. Esta cepa puede producir P (3HB-co-2% mol 3HHx) utilizando aceite de palmiste crudo (CPKO) como único sustrato de carbono. Sin embargo, hasta ahora no se ha estudiado la mejora de la producción de copolímero de P (3HB-co-3HHx) por esta cepa. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo mejorar la producción de copolímeros de P (3HB-co-3HHx) que contienen composiciones de monómeros de 3HHx superiores utilizando la metodología de superficie de respuesta (RSM). En la escala del matraz se estudiaron tres factores importantes para la producción de copolímeros de P(3HB-co-3HHx), es decir, la concentración de CPKO, la concentración de hexanoato de sodio y el tiempo de cultivo. Como resultado, se obtuvo un máximo de 3,6 ± 0,4 g/l de P(3HB-co-3HHx) con composiciones de 4% en moles de 3HHx utilizando la condición optimizada de RSM. Asimismo, la mayor composición de monómero 3HHx (5% molar) se obtuvo al aumentar la fermentación en un biorreactor con agitador de 10 L. Además, las propiedades del polímero producido eran similares a las del P(3HB-co-3HHx) comercializable, lo que hace que este polímero sea adecuado para una amplia gama de aplicaciones.

La contaminación plástica se ha convertido en uno de los desafíos ambientales globales más críticos. Evidentemente, la pandemia de COVID-19 ha contribuido a un enorme aumento de plásticos de un solo uso a base de petróleo, por ejemplo, guantes, trajes médicos protectores, mascarillas, botellas de desinfectante para manos, plásticos para llevar, envases de alimentos y kits de pruebas médicas1,2. Estos plásticos convencionales no son biodegradables y pueden permanecer en los vertederos y en el mar durante muchos años, lo que influye significativamente en la calidad del suelo, la actividad microbiana, la fauna y la flora3. Como resultado de su entrada en la cadena alimentaria, esto genera un riesgo para la salud humana4. Debido a estas preocupaciones, los plásticos biodegradables con poco o ningún impacto ambiental han ganado popularidad como alternativas a los plásticos a base de petróleo. Además, se espera que formen parte de futuras economías circulares que ayudarán a lograr aspectos de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS) de las Naciones Unidas5,6.

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son poliésteres producidos en la naturaleza como un compuesto de almacenamiento intracelular acumulado como reserva de energía por algunas bacterias y arqueas en condiciones de estrés7,8. Los PHA son termoplásticos con propiedades comparables a los polímeros tradicionales a base de petróleo, como el polipropileno (PP) y el polietileno (PE)9,10. Curiosamente, el polímero de la familia de los PHA demuestra una biodegradabilidad excepcional incluso cuando se expone al agua de mar11, lo que convierte a los PHA en un sustituto prometedor de los plásticos a base de petróleo. Los PHA se clasifican en dos grupos según el número de carbonos de los constituyentes monoméricos: PHA de cadena corta (SCL-PHA, C3-C5), que constan de 3 a 5 monómeros de carbono, y PHA de longitud de cadena media (MCL). -PHA, C6-C14), que constan de 6 a 14 monómeros de carbono en las unidades de 3-hidroxialcanoato12,13.

Actualmente, se han identificado más de 150 tipos de PHA14, incluidos homopolímeros y copolímeros, por ejemplo, poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB], poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) [P(3HB-co -4HB)], poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) [P(3HB-co-3HV)], poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexonato) [P(3HB-co-3HHx)] Entre los copolímeros de PHA, el poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) [P(3HB-co-3HHx)] es notablemente deseable debido a su flexibilidad superior y su parecido con varios polímeros populares a base de petróleo, lo que lo hace más aplicable a aplicaciones prácticas que el homopolímero rígido P (3HB) 15, 16. Además, debido a su excelente biocompatibilidad y biodegradabilidad, P (3HB-co-3HHx) es un copolímero candidato adecuado para aplicaciones biomédicas 17.

Sin embargo, los usos comerciales de los polihidroxialcanoatos (PHA) se han visto limitados por el costo relativamente alto de fabricación en comparación con los polímeros petroquímicos rivales. Por lo tanto, la mejora del medio de fermentación es un campo de investigación crítico debido a su impacto significativo tanto en el crecimiento de las células como en la expresión de metabolitos deseables, contribuyendo a la productividad total18. La metodología de superficie de respuesta (RSM) es un enfoque de optimización estadística que emplea diseños factoriales experimentales, como el diseño compuesto central (CCD) y el diseño Box-Behnken (BBD), que son los principales diseños de superficie de respuesta para optimizar el rendimiento del proceso y especifican el comportamiento de la respuesta. en el espacio de diseño especificado19,20. Ambos diseños examinan el impacto de la interacción de elementos que influyen sustancialmente en el desarrollo del producto. Las corridas experimentales CCD y BBD se utilizan para RSM para establecer el modelo matemático que relaciona los parámetros del proceso con los resultados21. Sin embargo, BBD normalmente requiere menos puntos de diseño que CCD, lo que puede dar como resultado un modelo de regresión de peor calidad.

Las cepas recombinantes productoras de PHA con genes que codifican enzimas de síntesis de PHA de diversas bacterias se han desarrollado para generar PHA de cadena corta y longitud de cadena media (SCL-MCL) de forma más eficaz22. Nuestro grupo de investigación diseñó recientemente una nueva cepa bacteriana productora de P (3HB-co-3HHx), C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24. Esta cepa produjo 3,1 ± 0,3 g/L de copolímero de P(3HB-co-3HHx) que contenía 2% en moles de una composición de monómero 3HHx cuando se utilizaron 10 g/L de aceite de palmiste crudo (CPKO) como única fuente de carbono24. Sin embargo, es necesario mejorar un medio de cultivo óptimo y las condiciones para la producción de PHA por parte de esta cepa para maximizar el rendimiento de P (3HB-co-3HHx). Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo optimizar las condiciones de fermentación de C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp utilizando RSM para mejorar la producción de P (3HB-co-3HHx). Además, la fermentación se realizó en un biorreactor de tanque agitado de 10 L para escalar la producción de P(3HB-co-3HHx). Finalmente, se evaluaron las propiedades de este polímero para confirmar que es prometedor para diversas aplicaciones.

La composición óptima del medio y las condiciones de cultivo para la producción de P(3HB-co-3HHx) y los efectos de interacción de cada parámetro se determinaron utilizando un diseño CCD de tres variables y cinco niveles. Las variables CCD incluyeron concentración de CPKO, g/L(X1), concentración de hexanoato de sodio, g/L(X2) y tiempo de cultivo, h(X3). Los resultados experimentales de la producción de P(3HB-co-3HHx) y las respuestas previstas se demuestran en la Tabla 1. Los resultados revelaron que la producción más alta de P(3HB-co-3HHx) (Ejecución 6), 3,54 g/L, se logró cuando la concentración de CPKO, hexanoato de sodio y el tiempo de cultivo fueron 15 g/L, 1,0 g/L y 54 h, respectivamente. Mientras que la producción más baja de P(3HB-co-3HHx) (Ejecución 3) fue de 0,53 g/L cuando las concentraciones de CPKO, hexanoato de sodio y el tiempo de cultivo fueron de 5 g/L, 3,0 g/L y 42 h, respectivamente. Los resultados del experimento CCD de los análisis de regresión múltiple se ajustaron a un modelo polinomial de segundo orden. Se empleó el siguiente modelo para ajustar la producción de P(3HB-co-3HHx) en términos de variables codificadas.

donde Y es la producción de P(3HB-co-3HHx) y X1, X2 y X3 son valores codificados de CPKO, hexanoato de sodio y tiempo de cultivo, respectivamente.

La prueba F y ANOVA para el modelo cuadrático de superficie de respuesta confirmaron la significancia estadística de la ecuación. R2 = 0,9885 fue el coeficiente de determinación en la ecuación de regresión de este estudio (Tabla 2). Como resultado, este modelo puede dar cuenta de aproximadamente el 98,85% de la variabilidad de la variable dependiente; el 1,15% restante estuvo influenciado por otros factores. Mientras que el R2 modificado, que considera el tamaño de la muestra y el número de términos25, fue de 0,9782. Los valores de R2 están constantemente entre 0 y 1. Cuanto mayor es el R2, más influyente es el modelo y mejor predice la respuesta21. Los valores P se utilizan para evaluar la importancia de cada coeficiente, lo que contribuye a comprender el patrón de interacciones mutuas entre las variables26. Cuanto más fuerte sea la importancia del coeficiente correspondiente27, menor será el valor de P. Se estimaron la prueba F y los valores P correspondientes, como se muestra en la Tabla 2. El modelo indica que los términos constante lineal (X1, X2, X3), cuadrático (X12, X22, X32) y de interacción (X1X3 y X2X3) son significativos (P < 0,05) (Tabla 2). Sin embargo, debido a que el valor P para todas las variables (X1, X2 y X3) fue menor que 0.0001, apenas indica qué variables son las más significativas para la producción de P(3HB-co-3HHx).

El coeficiente polinómico negativo en términos de interacción en este modelo sugiere que la interacción es oposicional. El valor F de falta de ajuste de 1,26 (Tabla 2) indica que la falta de ajuste no es estadísticamente significativa en comparación con el error estándar. Esta alta falta de ajuste del valor F tiene una probabilidad del 40,36 por ciento de ocurrir debido al ruido.

Para evaluar la interacción entre diferentes parámetros y determinar el valor óptimo de cada parámetro para la producción máxima de P(3HB-co-3HHx), se graficaron la respuesta entre CPKO(X1), hexanoato de sodio (X2) y tiempo de cultivo CPKO (X3). como se muestra en la Fig. 1. La Figura 1A muestra el efecto de CPKO y hexanoato de sodio en la producción de P (3HB-co-3HHx). La producción de P(3HB-co-3HHx) aumentó cuando la concentración de CPKO aumentó de 5,0 a 15,0 g/L. A una concentración más baja de CPKO (< 5,0 g/L), la producción de P(3HB-co-3HHx) disminuyó. Mientras que la producción de P(3HB-co-3HHx) aumentó al disminuir la concentración de hexanoato de sodio, de 3,0 a 1,0 g/L. A una concentración más alta de hexanoato de sodio (> 3,0 g/L), la producción de P(3HB-co-3HHx) disminuyó drásticamente.

Gráficas de contorno y superficie de respuesta descritas por el modelo, que representan la producción de P(3HB-co-3HHx) (g/L) como un valor de CPKO, hexanoato de sodio y tiempo de cultivo por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. El efecto combinado de CPKO y hexanoato de sodio (A); CPKO y tiempo de cultivo (B); hexanoato de sodio y tiempo de cultivo (C).

De acuerdo con los gráficos RSM 3D y los diagramas de contorno 2D de CPKO (X1) y el tiempo de cultivo (X2) en la producción de P (3HB-co-3HHx) (Fig. 1B), se demostró que P (3HB-co-3HHx) La producción mejoró significativamente cuando CPKO se incrementó de 5,0 a 15,0 g/L. Al mismo tiempo, se redujo cuando la concentración de CPKO descendió por debajo de 5,0 g/L. Además, la producción de P(3HB-co-3HHx) aumentó cuando el tiempo de cultivo bajó de 54 a 42 h. Sin embargo, a medida que aumentó el tiempo de cultivo (> 54 h), la producción de P(3HB-co-3HHx) disminuyó drásticamente.

El efecto del hexanoato de sodio y el tiempo de cultivo se muestran en la Fig. 1C. La producción de P(3HB-co-3HHx) aumentó con la disminución del hexanoato de sodio, de 3,0 a 1,0 g/L. Mientras que la producción de P(3HB-co-3HHx) disminuyó drásticamente a una concentración más alta de hexanoato de sodio (> 3,0 g/L) y aumentó con el tiempo prolongado, de 42 a 54 h. Además, la producción de P(3HB-co-3HHx) disminuyó cuando el tiempo de cultivo fue inferior a 42 h.

El modelo se verificó para los tres factores en el espacio de diseño para validar las predicciones de optimización. La composición y las condiciones del medio optimizadas para RSM se probaron por triplicado en una escala de 250 matraces. Los resultados demuestran que bajo las siguientes condiciones: CPKO, 14.4 g/L, hexanoato de sodio, 1.7 g/L y 43 h de tiempo de cultivo, la producción máxima de P(3HB-co-3HHx) es de 3.63 ± 0.4, con 5.54 ± Se obtuvieron 0,8 g/L de DCW, acercándose a la producción prevista de P(3HB-co-3HHx) de 3,55 g/L. Se compararon los valores previstos y experimentales y se calculó el residual. La diferencia relativa entre los niveles de producción de P(3HB-co-3HHx) reales y previstos fue del 0,3%. Como resultado, los modelos observados son muy precisos y el análisis RSM es un enfoque apropiado para predecir y mejorar el medio y las condiciones de fermentación.

El cultivo por lotes se llevó a cabo en un biorreactor de tanque agitado de 10 litros para mejorar la biomasa celular y la producción de P (3HB-co-3HHx) de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor que contenía 6 litros de medio optimizado para RSM (CPKO, 14,4 g/l, hexanoato de sodio, 1,7 g/l). La temperatura, el pH, la tasa de aireación y la velocidad de agitación se fijaron en 30 °C, 6,8, 0,25 vvm y 200 rpm, respectivamente. El crecimiento y la producción de P (3HB-co-3HHx) de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp aumentaron lentamente durante las 48 h de fermentación. Como se ve en la Fig. 2, la biomasa aumentó gradualmente durante la fermentación. Sin embargo, cuando el período de fermentación se extendió por encima del óptimo (42 h), la producción de P(3HB-co-3HHx) y el crecimiento celular se interrumpieron y comenzó la degradación de P(3HB-co-3HHx)28. La mayor producción de P(3HB-co-3HHx) fue a las 42 h cuando el DCW fue de 6.2 ± 0.3 g/L; La producción de P(3HB-co-3HHx) fue de 3,9 ± 0,3 g/L (Fig. 2). Además, cabe señalar que la fracción más alta de monómeros 3HHx (5% molar) se obtuvo al cultivar C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en un biorreactor de tanque agitado de 10 litros.

Perfil de fermentación por lotes de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp p en un biorreactor de tanque agitado de 10 l.

El copolímero P(3HB-co-5% molar 3HHx) extraído producido a partir de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se caracterizó mediante RMN 1H, FTIR, DSC y TGA para comprender las características estructurales y térmicas del copolímero para aplicaciones futuras. La RMN 1H se realizó para verificar la presencia del monómero 3HHx en el copolímero sintetizado por la cepa C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. La Figura 3 ilustra la banda de 1H NMR de H4, correspondiente a los grupos metileno C4, y la banda de 1H NMR de H6, correspondiente al grupo metilo C6, que indica la formación del copolímero P(3HB-co-3HHx)15,24,29 . Las fracciones de monómero del copolímero se calcularon de acuerdo con la relación de intensidad del espectro 1H de los componentes metilo30. Los valores de las fracciones de monómero 3HHx producidas fueron ligeramente superiores a los observados mediante análisis de GC gaseoso, con una variación de 1% molar.

Espectro de espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones (1H NMR) de P (3HB-co-3HHx) producido por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en un biorreactor de tanque agitado de 10 l.

Los espectros de absorción FTIR se escanearon en el rango de 4000 a 400 cm-1. Los espectros FTIR del copolímero sintetizado por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se representan en la Fig. 4. El principal pico de absorción de P(3HB-co-3HHx) se observó en el espectro a 1720,98 cm-1, que corresponde a la vibración de estiramiento del enlace éster carbonílico (C=O)31,32. Mientras que la vibración de estiramiento asimétrica C – O – C provoca el pico de absorción en 1269,35 cm − 133. El estiramiento C – H y el grupo –CH estuvieron representados por las otras bandas distintivas ubicadas en 2976,37 cm −1 y 1221,72–1375,09 cm −1. , respectivamente34,35. Para la fase amorfa, las vibraciones de estiramiento C – O y C – C se atribuyeron a una serie de bandas de absorción que van desde 1179,79 a 606,08 cm-133.

Espectro de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier de reflexión total atenuada (ATR-FTIR) de P (3HB-co-3HHx) producido por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en un biorreactor de tanque agitado de 10 l.

Las propiedades térmicas del copolímero P (3HB-co-5% molar 3HHx) producido por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se analizaron utilizando DSC y TGA. La Figura 5 demuestra el termograma de la temperatura de fusión (Tm), la temperatura de transición vítrea (Tg), mientras que la Figura 6 muestra las temperaturas de degradación (Td) del copolímero. Los valores se registraron a partir del segundo calentamiento para eliminar el historial térmico de las muestras anteriores. El termograma del copolímero extraído reveló dos temperaturas de fusión (Tm1 y Tm2) de aproximadamente 129 y 144 °C (Fig. 5). La Tc, Tg y Td del copolímero rondaron 89, 1,6 (Fig. 5) y 260,6 °C (Fig. 6), respectivamente.

Análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de P (3HB-co-3HHx) producido por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en un biorreactor de tanque agitado de 10 l.

Análisis termogravimétrico (TGA) de P(3HB-co-3HHx) producido por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en un biorreactor de tanque agitado de 10 l.

Los PHA son materiales poliméricos biodegradables producidos a partir de bacterias y arqueas en condiciones de estrés, como concentraciones limitantes de nutrientes de nitrógeno, fósforo, azufre u oxígeno y fuentes excesivas de carbono7,8,36. Aparentemente, los PHA se están convirtiendo en un problema cada vez más importante tanto en la comunidad científica como en el sector empresarial. Esto hace posible que se repongan los polímeros sintéticos, estableciendo en última instancia la economía circular prevista. P(3HB-co-3HHx) es un tipo práctico de copolímero de PHA. Tiene una temperatura de fusión y una cristalinidad más bajas que el homopolímero P(3HB), lo que puede atribuirse a la larga cadena lateral de la unidad 3-hidroxihexanato (3HHx)37. Los copolímeros están compuestos de 5 a 15% en moles de 3HHx y tienen propiedades elásticas que los hacen adecuados para diversas aplicaciones38.

Anteriormente, Han et al. informaron que las cepas de tipo salvaje, Aeromonas spp., pueden producir P (3HB-co-3HHx) a partir de aceites vegetales y ácidos grasos a través de la PHA sintasa, que tiene una especificidad de sustrato excepcionalmente amplia para (R) -3-hidroxiacil-CoA de C4-C639. En este estudio, el copolímero P(3HB-co-3HHx) fue sintetizado por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24, una cepa bacteriana recientemente diseñada, y la producción de P(3HB-co-3HHx) se mejoró utilizando RSM. Los resultados mostraron que los 3,6 ± 0,4 g/L más altos de P (3HB-co-4 % mol de 3HHx) se obtuvieron utilizando las condiciones optimizadas para RSM en la escala del matraz. Además, la composición del monómero 3HHx se incrementó al 5% molar cuando se cultivó C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en el biorreactor de 10 litros durante 48 h de fermentación. Este resultado fue similar al obtenido por Ouyang et al.40. Llevaron a cabo experimentos en matraz agitado para producir P(3HB-co-3HHx) a partir de Aeromonas hydrophila, cuya composición de monómero controlable del 15% en el tipo salvaje al 3-12% en el recombinante básicamente cambiando la proporción de gluconato a láurico. ácido en los medios de cultivo en 48 h de fermentación. La producción de P(3HB-co-3HHx) estudiada en Cupriavidus sp. Según lo informado por Volova et al.22, C. eutrophus B10646 podría producir rendimientos de biomasa significativos (5,6 g L-1) y un alto contenido del polímero (60–75%), incluida una alta fracción molar 3HHx, bajo la condiciones de crecimiento adecuadas. Sin embargo, las características fisicoquímicas y mecánicas de los copolímeros de P(3HB-co-3HHx) se pueden cambiar ajustando la relación 3HB/3HHx. Además, Kawashima et al.41 encontraron que la región aguas abajo de phaP1Re era un sitio ventajoso para integrar genes que se sobreexpresan durante la acumulación de PHA en R. eutropha. Los hallazgos también demostraron que las características de polimerización de la PHA sintasa estaban influenciadas por el tipo de fase que coexistía en la superficie de los gránulos de PHA, alterando el polímero de PHA resultante (3HB-co-3HHx). La sustitución de fasinas es un método técnico innovador para controlar la composición de los copoliésteres de PHA. Además, Murugan et al.42 investigaron la oleína de palma (PO) y la fructosa como fuentes de carbono para la biosíntesis de P(3HB-co-3HHx) mediante C. necator Re2058/pCB113 recombinante. Los cultivos en matraz agitado que utilizaron 5 g/l de PO como única fuente de carbono produjeron un peso seco celular (CDW) de 5,13 g/l, 67 % de PHA/CDW y un copolímero que comprendía 27 % en moles de 3HHx. P (3HB-co-3HHx) con 4–15% molar de monómero 3HHx tenía pesos moleculares en el rango de 5,47–6,85 × 105 Da, que era al menos dos veces más que los valores informados anteriormente.

En este estudio, se aplicó RSM empleando CCD para mejorar la producción de P (3HB-co-3HHx) a escala de matraz. El resultado muestra que bajo las siguientes condiciones: CPKO, 14.4 g/L, hexanoato de sodio, 1.7 g/L y 43 h de tiempo de cultivo, se obtuvo la producción máxima de P(3HB-co-3HHx) de 3.63 ± 0.4, acercándose el RSM predijo una producción de P(3HB-co-3HHx) de 3,55 g/L. Estos resultados demostraron la precisión del modelo RSM para la producción de P (3HB-co-3HHx). Además, en comparación con la condición no optimizada, el medio optimizado puede mejorar la producción de la composición del monómero P (3HB-co-3HHx) y 3HHx en 1,2 y dos veces, respectivamente. En base a esto, la mejora de la producción de P (3HB-co-3HHx) estuvo ligeramente presente; sin embargo, RSM mejoró con éxito la composición del monómero 3HHx. Anteriormente, se informó que la RSM era un método eficaz para mejorar la biosíntesis de PHA por parte de muchos microorganismos43,44,45,46,47. Sin embargo, el uso de RSM para mejorar la producción de P(3HB-co-3HHx) ha sido limitado.

Se ha informado sobre la aplicación de la fermentación discontinua por parte de varias bacterias para aumentar la biosíntesis de PHA en el biorreactor48,49,50,51,52. Sin embargo, en el presente estudio, la producción de P (3HB-co-3HHx) no se puede mejorar utilizando este enfoque. Sólo la composición del monómero 3HHx se incrementó al 5% molar, lo que puede estar relacionado con el período de recolección reducido. Además, los cultivos por lotes son fáciles de operar pero tienen una productividad intrínseca pobre debido a la concentración restrictiva de los suministros de carbono y nitrógeno al comienzo de la fermentación53. Por el contrario, el método de fermentación por lotes alimentados produce una alta concentración celular, mejora la productividad y reduce la inhibición del sustrato o del producto final54.

En este estudio, el copolímero P(3HB-co-3HHx) que contiene un 5% molar de composición de monómero 3HHx fue sintetizado por la cepa diseñada, C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp utilizando CPKO y hexanoato de sodio como carbono y precursor, respectivamente. . El copolímero se extrajo y caracterizó para comprender las características estructurales y térmicas del copolímero para su uso posterior. El espectro de RMN 1H confirmó la existencia del monómero 3HHx en copolímeros de P (3HB-co-3HHx) sintetizados por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. Fue similar a los espectros de 1H NMR informados por Wong et al.30 y Bhubalan et al.55. Además, según el cálculo de la composición del monómero 3HHx a partir de los espectros de RMN 1H, este polímero contiene entre un 5% y un 6% en moles de monómero 3HHx, similar a los resultados del análisis de GC. Los espectros FTIR del copolímero demostraron el pico de absorción característico de los copolímeros P(3HB-co-3HHx) a 1720,98 y 1269,35 cm-1, que corresponde a la vibración de estiramiento del enlace éster carbonílico (C=O) y al C-O- asimétrico. C vibración de estiramiento, respectivamente31,32. Estos resultados establecieron que el copolímero producido era P(3HB-co-3HHx).

Las propiedades térmicas del copolímero P (3HB-co-5% molar 3HHx) producido por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se analizaron utilizando DSC y TGA. El termograma DSC del copolímero extraído reveló dos temperaturas de fusión (Tm1 y Tm2) de aproximadamente 129 y 144 °C. Se pueden detectar dos temperaturas de fusión para los mcl-PHA, lo que puede estar relacionado con la formación de dos fases cristalinas diferentes (fase I y fase II)56. La Tc, Tg y Td del copolímero fueron 89, 1,6 y 260,6 °C, respectivamente. Estos resultados son similares a los estudiados previamente por Murugan et al.42. Han informado que la Tm y la Tg de P (3HB-co-4% molar 3HHx) producido a partir de C. necator Re2058/pCB113 fueron 164 y -1 °C, respectivamente.

El P(3HB)Td se informó a 280 °C56,57,58. El copolímero Td en este estudio fue menor debido a la incorporación del monómero 3HHx. En general, los copolímeros de P(3HB-co-3HHx) tuvieron una Tm y Td más bajas que el P(3HB), aunque no hubo una asociación discernible entre estas características y las fracciones molares de 3HHx22.

En este estudio, la producción de copolímeros de P(3HB-co-3HHx) mediante una cepa diseñada de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se mejoró utilizando RSM. En condiciones óptimas de RSM, esta cepa puede producir 3,6 ± 0,4 de P (3HB-co-3HHx) que contiene composiciones de 3HHx al 4% en moles. En comparación con la condición no optimizada, el medio optimizado puede mejorar la producción de la composición del monómero P (3HB-co-3HHx) y 3HHx en 1,2 y dos veces, respectivamente. Además, curiosamente, la composición del monómero 3HHx se mejoró al 5% molar cuando se realizó la fermentación en un biorreactor de tanque agitado de 10 L, que fue 2,5 veces mayor que en la condición no optimizada. Los resultados del grupo funcional y la estructura química verificaron que el polímero era P(3HB-co-3HHx), y las propiedades térmicas del polímero producido eran similares al P(3HB-co-3HHx) industrial.

La cepa recombinante C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se cultivó como describen Trakunjae et al.24. Brevemente, la cepa bacteriana se cultivó en agar rico en nutrientes (NR) suplementado con 50 µg/ml de kanamicina a 30 °C durante 24 h. Luego, se transfirieron tres bucles completos de una colonia bacteriana en medio NR suplementado con 50 µg/ml de kanamicina para preparar el inóculo bacteriano. Después de eso, se incubaron los matraces de inóculo a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 8 h o hasta que la densidad óptica (OD600) alcanzó 4.

El 3% v/v de inóculo de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se transfirió al medio de producción P(3HB-co-3HHx). El medio mineral (MM) para la producción de P(3HB-co-3HHx) estuvo compuesto por 0,45 g/L de K2SO4, 4,6 g/L de Na2HPO4, 4,0 g/L de NaH2PO4, 0,54 g/L de CO(NH2)2 [ Urea], 0,39 g/L de MgSO4, 0,062 g/L de CaCl2 y 1 mL/L de solución de oligoelementos (TE)59. La solución de TE estaba compuesta por ZnSO4·7H2O, 2,4 g/L; FeSO4·7H2O, 15 g/L; MnSO4·H2O, 2,4 g/L, y CuSO4·5H2O, 0,48 g/L disueltos en HCl 0,1 M. El pH del MM se ajustó a 6,8 antes de la esterilización. CPKO, hexanoato de sodio y CaCl2 se esterilizaron por separado a 121 °C durante 20 min. Mientras que la solución de urea y TE se filtraron usando un filtro de membrana estéril de 0,2 um y se agregaron al medio esterilizado a la concentración requerida. La biosíntesis de P(3HB-co-3HHx) de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp se realizó a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 48 h.

Las células bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 8.000 rpm, 4 °C durante 10 min. Después de eso, los sedimentos celulares se lavaron con agua destilada (DW), seguido de una solución mixta de DW y hexano en una proporción de 1:1 para eliminar los residuos de aceite. A continuación, los sedimentos celulares se volvieron a lavar con DW para eliminar los restos de hexano y se transfirieron a una botella de joyería previamente pesada. Luego, las botellas que contenían sedimentos de células bacterianas se congelaron a -20 °C durante la noche y se liofilizaron utilizando un liofilizador hasta que se secaron por completo. Finalmente, el peso de la célula liofilizada se registró en g/L. Al mismo tiempo, se examinaron el contenido de PHA y la composición de monómeros mediante análisis de cromatografía de gases (GC).

RSM, un método de modelado práctico, es un conjunto de herramientas estadísticas y matemáticas para crear experimentos y optimizar las variables del proceso de influencia60. En este estudio, la producción de copolímeros de P (3HB-co-3HHx) se mejoró utilizando el RSM basado en el diseño compuesto central (CCD). Se utiliza comúnmente para construir un polinomio de segundo orden para las variables de respuesta sin un diseño factorial completo de experimentos.

En este estudio se utilizaron tres factores significativos, es decir, CPKO (g/L) (X1), hexanoato de sodio (g/L) (X2) y tiempo de cultivo (h) (X3). Cada variable se codificó en cinco niveles (1,68, 1, 0, + 1 y + 1,68) según el diseño CCD para definir las características de la superficie de respuesta en la región óptima. Se diseñaron un total de veinte procesos de fermentación según la ecuación. (1), incluidas cinco ejecuciones de fermentación replicadas en los puntos centrales.

donde k es el número de variables independientes y n0 es el número de repeticiones de experimentos en el punto central

Los niveles codificados y reales de los factores significativos se presentan en la Tabla 3. La matriz de diseño de las corridas de fermentación probadas se demuestra en la Tabla 1. Los valores promedio se informaron de corridas experimentales por triplicado. Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el software Design-Expert v7.0.0 (Stat-Ease, Inc. MN, EE. UU.). Los resultados experimentales del diseño CCD se ajustaron con una ecuación polinómica de segundo orden mediante técnicas de regresión múltiple, como se muestra en la ecuación. (2).

donde Y es la respuesta medida predictiva; Xi y Xj son las variables independientes; β0 representa la intersección; y βi, βii y βlj son los coeficientes de regresión del modelo61. El modelo generado para tres variables independientes se muestra en la ecuación. (3).

donde Y es la respuesta prevista de la producción de P(3HB-co-3HHx) (g/L); β1, β2 y β3 son coeficientes lineales; β11, β22 y β33 representan coeficientes cuadráticos; β12, β13 y β23 son coeficientes de interacción; X1, X2 y X3 representan valores codificados de CPKO (X1), hexanoato de sodio (X2) y tiempo de cultivo (X3).

Los valores de los tres factores probados, CPKO, hexanoato de sodio y tiempo de cultivo, se eligieron aleatoriamente del espacio de diseño para verificar la producción de P(3HB-co-3HHx) por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en un batido. modelo de matraz. En este experimento, los demás componentes del medio estaban en niveles fijos.

La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de tanque agitado de 10 L (Modelo MDFT-N-10L, Marubishi, Japón) para mejorar la producción de P (3HB-co-3HHx) por C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. El 3% v/v de inóculo bacteriano se transfirió al biorreactor que contenía 6 litros de medio optimizado. El cultivo discontinuo se llevó a cabo a 30 °C con pH inicial y velocidades de agitación de 6,8 y 200 rpm, respectivamente. El pH del caldo de cultivo se mantuvo a pH 6,8 durante la fermentación añadiendo HPO3 o NaOH usando un controlador de pH. El caudal de aire se fijó en 0,25 vvm. La biomasa celular y la producción de P(3HB-co-3HHx) se evaluaron cada 6 h durante 48 h de fermentación. Las fermentaciones se realizaron por triplicado y se determinaron los valores medios.

Los 10 g de células liofilizadas se disolvieron en 1 litro de cloroformo y se agitaron durante 3 a 5 días a temperatura ambiente para extraer los copolímeros de P (3HB-co-3HHx). Luego, se eliminaron los restos celulares filtrando la suspensión de células bacterianas utilizando papel de filtro (Whatman No. 1). Después de eso, la solución de cloroformo disuelta de P(3HB-co-3HHx) se evaporó a aproximadamente 100 ml usando un evaporador rotatorio. Posteriormente, la solución evaporada se añadió gota a gota a 100 ml de metanol enfriado con hielo y se agitó durante 1 h. Finalmente, el polímero purificado se separó mediante filtración utilizando una membrana de PTFE de 0,45 µm y se secó al aire durante 3 a 5 días44 antes de usarlo para experimentos adicionales.

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones (1H NMR) es una técnica sencilla para investigar la composición del polímero PHA. En este estudio, los copolímeros de P(3HB-co-3HHx) purificados se disolvieron en cloroformo deuterado (CDCl3) a 25 mg/ml para aplicarlos al análisis de RMN. La RMN 1H en estado de solución se llevó a cabo en un espectrofotómetro Jeol JNM-ECZ-400R/S1 (JEOL, Ltd., Tokio, Japón) que resonaba a 500 MHz. Los cambios químicos se denominaron tetrametilsilano (TMS). Al mismo tiempo, se utilizó adamantano como estándar externo.

Los grupos funcionales de los copolímeros de P (3HB-co-3HHx) purificados se detectaron mediante espectroscopia IR por transformada de Fourier (FTIR). El análisis FTIR se realizó utilizando un espectrómetro FTIR (Thermo Scientific Nicolet IR200, Waltham, MA, EE. UU.). Los 128 escaneos se realizaron en modo de reflexión total atenuada (ATR). Además, los espectros se lograron en el rango de 4000 a 400 cm-1 con una resolución de 4 cm-1.

Los copolímeros de P (3HB-co-3HHx) purificados se analizaron para determinar sus propiedades térmicas mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) y análisis termogravimétrico (TGA). El análisis DSC se analizó mediante DSC25 (TA Instruments, New Castle, DE, EE. UU.) utilizando un caudal de nitrógeno de 30 ml/min. Se colocaron alrededor de 3 a 5 mg de copolímeros de P (3HB-co-3HHx) purificados en una cubeta hermética de aluminio Tzero, se taparon y se calentaron de 25 a 200 °C a una velocidad de calentamiento de 15 °C/min. Luego, las muestras fundidas se mantuvieron a 200 °C durante 2 minutos y se redujeron rápidamente a -40 °C. Finalmente, se calentaron repetidamente de -40 a 200 °C a una velocidad de calentamiento de 15 °C/min. La temperatura de fusión (Tm), la temperatura de cristalización (Tc) y la temperatura de transición vítrea (Tg) se detectaron y analizaron a partir del termograma DSC. Para el análisis de TGA, se llenaron aproximadamente 5 mg de copolímeros de P (3HB-co-3HHx) purificados en una bandeja de aluminio y se analizaron utilizando el instrumento Pyris 1 TGA (Perkin Elmer, EE. UU.). La temperatura de calentamiento se ajustó de 30 a 900 °C a una velocidad de calentamiento de 20 °C/min bajo una atmósfera de nitrógeno.

La determinación de DCW fue modificada de Trakunjae et al.24. Brevemente, se transfirió 1 ml de suspensión de cultivo celular a tubos Eppendorf previamente pesados ​​y se centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos. Luego, las células recolectadas se lavaron con agua destilada, seguido de una solución mixta de DW y hexano en una proporción de 1:1 para eliminar los residuos de aceite. Luego se lavó con DW para eliminar restos de hexano y se centrifugó a 8.000 rpm durante 10 min. A continuación, los sedimentos celulares obtenidos se congelaron a -20 °C durante la noche y se liofilizaron utilizando un liofilizador durante 2 a 3 días. Finalmente, los tubos Eppendorf que contenían células liofilizadas se pesaron para verificar la estabilidad y se calculó el DCW en g/L.

El contenido de PHA y la composición de monómeros se analizaron mediante la técnica de metanólisis siguiendo a Braunegg et al.62. Brevemente, se agregaron 15 a 20 mg de células liofilizadas al tubo de ensayo, seguido de 2 ml de cloroformo y solución de metanólisis (mezcla de 85% v/v de metanol y 15% p/v de H2SO4). Los tubos se calentaron a 100 ̊ C durante 180 min y luego se enfriaron a temperatura ambiente. Después de eso, se añadió 1 ml de DW a los tubos y se mezcló vigorosamente durante 1 minuto usando un mezclador vórtex. El PHA rico en cloroformo de la capa inferior se recogió utilizando una pipeta para pastos. Luego, eliminar los residuos de agua utilizando Na2SO4. Se preparó una solución mixta de 500 ml de solución de PHA rica en cloroformo y 500 ml de éster metílico caprílico (CME) al 0,2 % (v/v) (estándar interno) para el análisis por GC. El análisis se realizó utilizando Shimadzu GC-2014 plus (Shimadzu, Japón) suministrado con una columna Restek RTX-1 (Restek, EE. UU.) y un detector de ionización de llama (FID). Los 2,0 µL de la solución de muestra preparada se inyectaron en la máquina GC. Se utilizó nitrógeno como gas portador para el análisis por GC. Además, las temperaturas del inyector y del detector se fijaron en 270 °C y 280 °C, respectivamente.

Todos los datos experimentales se describieron como media ± error estándar. El análisis estadístico se realizó mediante el software estadístico SPSS 17.0 (SPSS para Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Las respuestas experimentales se examinaron mediante un análisis de varianza bidireccional (ANOVA). Los coeficientes de regresión lineal, cuadrática y de interacción de cada término del modelo se calcularon utilizando el valor F con una probabilidad (P) <0,05. Además, se analizó la significación estadística de cada término del polinomio y todos los coeficientes se investigaron utilizando el software Design-Expert® v7.0.0 (Stat-Ease, Inc. MN, EE. UU.).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a C. Trakunjae o P. Vaithanomsat.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Instituto de Investigación y Desarrollo de la Universidad Kasetsart (KURDI), número de subvención FF (KU) 28.65.

Instituto Kasetsart de Mejora de Productos Agrícolas y Agroindustriales (KAPI), Universidad Kasetsart, Bangkok, 10900, Tailandia

Chanaporn Trakunjae, Antika Boondaeng, Waraporn Apiwatanapiwat, Phornphimon Janchai y Pilanee Vaithanomsat

Laboratorio de Investigación de Ecobiomateriales, Facultad de Ciencias Biológicas, Universiti Sains Malaysia USM, 11800, Penang, Malasia

Pronto Zher Neoh y Kumar Sudesh

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Conceptualización, redacción: preparación del borrador original, CT; Revisión y edición, CT, PV y KS; Administración de proyectos y adquisición de fondos, PV y CT; Metodología y análisis de datos, CT, SZN, AB, WA y PJ Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Pilanee Vaithanomsat.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Trakunjae, C., Boondaeng, A., Apiwatanapiwat, W. et al. Optimización estadística de la producción de copolímeros de P(3HB-co-3HHx) mediante Cupriavidus necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp y caracterización de sus propiedades. Representante científico 13, 9005 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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Recibido: 14 de febrero de 2023

Aceptado: 29 de mayo de 2023

Publicado: 02 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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