El ácido pulcherrimínico modula la disponibilidad de hierro y protege contra el estrés oxidativo durante las interacciones microbianas.

Sep 25, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 2536 (2023) Citar este artículo

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Los sideróforos son moléculas solubles o incrustadas en membranas que se unen a la forma oxidada del hierro, Fe (III), y desempeñan funciones en la adquisición de hierro por parte de los microorganismos. Los sideróforos unidos a Fe (III) se unen a receptores específicos que permiten a los microbios adquirir hierro. Sin embargo, ciertos microbios del suelo liberan un compuesto (ácido pulcherrimínico, PA) que, al unirse al Fe(III), forma un precipitado (pulcherrimina) que aparentemente funciona reduciendo la disponibilidad de hierro en lugar de contribuir a la adquisición de hierro. Aquí, utilizamos Bacillus subtilis (productor de PA) y Pseudomonas protegens como modelo de competencia para mostrar que el PA está involucrado en un sistema peculiar de gestión del hierro. La presencia del competidor induce la producción de PA, lo que lleva a la precipitación de Fe (III) como pulcherrimina, lo que previene el estrés oxidativo en B. subtilis al restringir la reacción de Fenton y la formación nociva de ROS. Además, B. subtilis utiliza su conocido sideróforo bacilibactina para recuperar Fe (III) de la pulcherrimina. Nuestros hallazgos indican que la AP desempeña múltiples funciones al modular la disponibilidad de hierro y conferir protección contra el estrés oxidativo durante la competencia entre especies.

El hierro (Fe) es un metal esencial requerido en altas concentraciones celulares para la supervivencia y el crecimiento de la mayoría de los organismos vivos en la Tierra. Si bien es abundante en el suelo, su solubilidad y, por tanto, su biodisponibilidad son muy bajas a pH circuneutral (aproximadamente 10-10 M)1. Para resolver este enigma de alta demanda pero baja oferta, las bacterias del suelo producen sideróforos, compuestos de bajo peso molecular con alta afinidad por el Fe (III) 2. Los sistemas de transporte específicos permiten que las células tomen el Fe y lo utilicen en diversas vías celulares y proteínas3,4,5. Los microorganismos del suelo a menudo compiten por el Fe y han desarrollado mecanismos para maximizar la adquisición de Fe, incluida la producción de múltiples sideróforos con una variedad de afinidades por el Fe y la expresión de varios receptores en la superficie celular capaces de unirse a sideróforos, que a veces incluyen xenosideróforos6,7,8 ,9. En la competencia entre especies, la secreción de sideróforos puede conferir una ventaja de crecimiento a través de la rápida monopolización del Fe10. Sin embargo, el secuestro de Fe por parte de los sideróforos puede ser un arma de doble filo, ya que los competidores también pueden engañarlos, adquiriendo así Fe sin compartir el costo metabólico de la biosíntesis de los sideróforos9,11.

Utilizando la misma vía de síntesis, B. subtilis produce dos sideróforos: el ácido 2,3-dihidroxibenzoico (DHB; una función catecol) de afinidad de unión relativamente débil y la bacilibactina de afinidad de unión fuerte (BB; tres funciones catecol)12. El ácido pulcherrimínico (PA), otra molécula quelante de Fe producida por levaduras y muchas bacterias, incluida B. subtilis13,14,15, alberga dos grupos hidroxamato y forma el complejo rojo insoluble de pulcherrimina al unirse al Fe(III)15,16,17. Recientemente, se demostró que la acumulación extracelular de pulcherrimina (PA-Fe) restringe la expansión de la biopelícula y se sugirió que la PA actúa como una señal intercelular que desencadena la transición de la fase exponencial a la estacionaria en B. subtilis14,18. Pulcherrimin se describió por primera vez en un pequeño grupo de levaduras, incluida Candida spp. y Kluyveromyces spp.15,19. En estos organismos, se demostró que la producción de PA tiene actividad antagónica, probablemente a través del agotamiento del Fe20. En Kluyveromyces lactis, se sugirió que el PA podría actuar como sideróforo, una idea contradictoria ya que el complejo pulcherrimina es insoluble y, aparentemente, no es una fuente biodisponible de Fe19,21. De hecho, casi todos los estudios previos en levaduras y Bacillus estipulan que la PA se une irreversiblemente al Fe (III) y, por lo tanto, no desempeña ningún papel en la adquisición de Fe.

Otro aspecto importante de la homeostasis del Fe en B. subtilis es la formación de una biopelícula. Anteriormente demostramos que tanto la matriz de biopelícula como la producción de sideróforos son necesarios para que el organismo adquiera Fe de los óxidos precipitados22 y que el Fe unido a biopelículas puede usarse como fuente local de Fe23. Otro estudio demostró la importancia del Fe(III) en la capa profunda del biofilm, sirviendo como aceptor terminal de electrones en ausencia de oxígeno24. Por tanto, el Fe unido a biopelículas parece esencial para la función de las biopelículas además del crecimiento celular. Los sideróforos y la formación de biopelículas contribuyen a la adquisición de Fe y a la homeostasis en las bacterias formadoras de biopelículas22,25. Sin embargo, se sabe poco sobre la ventaja ecológica de secretar ligandos precipitantes como la PA en el contexto de la competencia microbiana y el destino del Fe una vez complejo con la PA.

En este trabajo, utilizamos un modelo bacteriano de dos especies para investigar el papel de la pulcherrimina, si lo hubiera, en la guerra del hierro. Bacillus y Pseudomonas son dos géneros que a menudo se encuentran juntos en la rizosfera, donde interactúan con las raíces de las plantas pero probablemente también compiten por los mismos recursos. De hecho, se demostraron muchas interacciones antagónicas entre B. subtilis y varias especies de Pseudomonas26,27. Sin embargo, se sabe menos sobre la adquisición de nutrientes, particularmente Fe, durante la competencia entre los géneros Bacillus y Pseudomonas. Aquí, utilizando un modelo bacteriano de dos especies, Bacillus subtilis (productor de PA) y varias especies de Pseudomonas, mostramos que B. subtilis produce PA en interacción por pares con Pseudomonas protegens Pf-5, creando una fuente local de Fe(III) precipitado y es capaz de absorber Fe del complejo pulcherrimina mediante la producción de bacilibactina (BB), un potente quelante de Fe. También mostramos que la pulcherrimina mitiga el estrés oxidativo en este organismo, aumentando la supervivencia y la formación de biopelículas mientras compite con Pf-5. Nuestras observaciones proporcionan una nueva comprensión del papel fisiológico de la pulcherrimina, que no es un sideróforo ni un secuestrador de Fe inaccesible, sino que proporciona una fuente local de Fe al tiempo que previene la formación de especies reactivas de oxígeno nocivas.

Para explorar las estrategias defensivas utilizadas por B. subtilis en interacción con otras bacterias del suelo, realizamos ensayos de interacción por pares en el tiempo entre B. subtilis NCIB 3610 y tres especies de Pseudomonas (P. fluorescens WCS365, P. capeferrum WCS358 y P. protegens Pf-5) aislados de la rizosfera y utilizados como agentes de biocontrol en cultivos28,29. Estas tres especies de Pseudomonas fueron elegidas por sus diferencias en la producción de metabolitos secundarios30,31,32. Las interacciones se examinaron en dos medios diferentes: MSgg, comúnmente utilizado para estudiar la formación de biopelículas en B. subtilis y que se utilizó anteriormente en Bacillus spp. – Interacciones por pares de Pseudomonas27 y medio Murashige y Skoog (MS), comúnmente utilizado para cultivar plantas y examinar sus interacciones con bacterias beneficiosas. En este caso, la EM se complementó con glicerol y glutamato para promover la formación de biopelículas de B. subtilis33. En MSgg, el Fe se proporciona como sal (FeCl3; inorgánico), que en condiciones óxicas forma hidróxidos y óxidos férricos que precipitan. En MS, el Fe se proporciona como un complejo orgánico (Fe-EDTA) que conserva su solubilidad a lo largo del tiempo. No obstante, en ambas condiciones, el Fe no está fácilmente biodisponible para B. subtilis. Con el tiempo en MSgg, B. subtilis envolvió tanto a P. fluorescens WCS365 como a P. capeferrum WCS358, pero las colonias de B. subtilis y Pf-5 no establecieron un contacto físico, lo que sugiere actividades antagónicas mediadas por moléculas difusibles (Fig. 1a). Las colonias una al lado de la otra en MS muestran una falta de interacción, a excepción de un halo rojo que rodeaba la colonia de B. subtilis en competencia con Pf-5 (Fig. 1b). Este halo rojo estuvo ausente cuando B. subtilis estaba solo en MS, pero siempre estuvo presente en MSgg, como se describió anteriormente14 (Fig. 1a). El ácido pulcherrimínico (PA) es el único pigmento conocido producido por B. subtilis14. Es incoloro pero forma el complejo rojo insoluble de pulcherrimina al unirse el Fe (III) fuera de la célula34. B. subtilis eliminado para yvmC, un gen que codifica la proteína responsable de la síntesis de PA, desafiado con Pf-5 en ambos medios (MS y MSgg) careció de producción del pigmento rojo en todas las condiciones (Fig. 1a, b). La complementación del operón yvmC-cypX en el locus amyE restableció la síntesis de pigmentos (Figura 1a complementaria), lo que demuestra que el fenotipo "rojo" se debe a la producción de PA.

a Imágenes representativas de biopelículas de B. subtilis WT y ∆yvmC, en competencia con Pseudomonas WCS365, WCS358 y Pf-5. Se tomaron fotografías a intervalos regulares en MSgg y en (b), medio MS. El contraste de las imágenes se ajustó para permitir una visualización clara. c Análisis de citometría de flujo que muestra la distribución de la intensidad de fluorescencia del indicador transcripcional basado en YFP para yvmC solo (negro) frente a las especies de Pseudomonas WCS365 (verde azulado), WCS358 (púrpura) y Pf-5 (rosa). d B. subtilis que alberga el indicador fluorescente para la producción de PA (PyvmC - yfp) se cultivó en MS durante 24 h con y sin especies de Pseudomonas. El porcentaje de células fluorescentes (YFP+) se analizó mediante citometría de flujo. Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Se presentan experimentos e imágenes representativos. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, P <0,05, ANOVA unidireccional y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3. Barra de escala, 5 mm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En MSgg, B. subtilis mostró una expresión fuerte y uniforme del bioinformador PyvmC-yfp en toda la biopelícula (Figuras complementarias 2a, b). En contraste, en MS, solo las células de B. subtilis junto a Pf-5 mostraron expresión de PyvmC-yfp y, por lo tanto, producción de PA (Figura complementaria 2c). El análisis de citometría de flujo de la proporción de células que expresan PyvmC-yfp confirmó un claro cambio de población cuando B. subtilis se cultivó cerca de Pf-5 con casi ~95% de YFP+, en comparación con solo ~30% para las colonias de B. subtilis cultivadas en la presencia de WCS365 o WCS358 (Fig. 1c, d).

Se sabe que Pf-5 secreta metabolitos secundarios perjudiciales para B. subtilis, incluidos 2,4-DAPG y pioluteorina27,35, que podrían ser responsables de desencadenar la producción de PA. Desafiar a B. subtilis con el mutante Pf-5 ∆phlD, incapaz de sintetizar estos dos metabolitos secundarios, no disminuyó significativamente el número de células que expresan yvmC (reportero de PyvmC-yfp) (Figura complementaria 1c). Sin embargo, las células expresaban PyvmC-yfp en menor grado en comparación con WT cuando estaban en presencia de Pf-5, lo que sugiere que DAPG o pioluteorina podrían estar involucrados en la producción de PA (Figura complementaria 1b). La adición de DAPG cerca de la colonia de B. subtilis desencadenó la expresión de PyvmC-yfp (Figura complementaria 2d). Curiosamente, después de eliminar una porción de agar entre 3610 y Pf-5 para eliminar la influencia de las moléculas de difusión media, aproximadamente el 70% de las células de la población todavía expresaban PyvmC-yfp (Figura complementaria 1c). Al no poder identificar directamente todas las moléculas responsables de desencadenar la producción de PA, nuestras observaciones sugieren que es el resultado de un efecto de los metabolitos secundarios volátiles y de difusión media del Pf-5.

En ambos medios, en ausencia de Pf-5, WT y ∆yvmC (mutante PA) no mostraron diferencias significativas en los fenotipos de biopelículas, la curva de crecimiento y la biomasa (Fig. 2a, b), excepto en MSgg en puntos temporales posteriores donde ∆ yvmC siguió expandiéndose como se observó anteriormente (Fig. 1a, b)14. Sin embargo, Pf-5 impidió la formación de biopelículas en WT en ambos medios, y este efecto se exacerbó en el mutante ∆yvmC, observado por la falta de arrugas en presencia de Pf-5 (Fig. 1a, b). Además, Pf-5 detuvo por completo el crecimiento y la supervivencia de ∆yvmC (Fig. 2c, d). En conjunto, estos hallazgos demostraron que la secreción de PA protege las células de B. subtilis y permite la formación de biopelículas contra Pf-5.

a Recuentos de UFC y biomasa (OD600) de WT y ∆yvmC solos en MSgg (ns no significativo, *P = 1,82 × 10−2) y (b), en MS (ns no significativo). c Recuentos de UFC y biomasa (OD600) de WT y ∆yvmC con Pf-5 en MSgg (ns no significativo, ** = P <0,01) y (d), en MS. (ns no significativo, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P = 8,93 × 10−4, ANOVA de dos vías, sidak). Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Se presentan experimentos representativos. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La secreción de un quelante de Fe fuerte e insoluble, como el ácido pulcherrimínico, podría afectar la acumulación de Fe en la biopelícula. Así, se cuantificó el contenido total de Fe presente en las colonias (biopelículas + células) y células (contenido de Fe intracelular) de B. subtilis WT y mutante ∆yvmC (mutante PA). Hubo una ligera disminución de la acumulación de Fe en la biopelícula ∆yvmC (1,58E–7 M) en comparación con el WT solo (2,92E–7 M) en medio MSgg cuando la PA se produce en gran medida (Fig. 3a), mientras que el contenido de Fe intracelular permaneció similar (Figura complementaria S3a). En el mismo medio, B. subtilis WT en presencia de Pf-5 mostró un aumento de aproximadamente 3 veces en el contenido de Fe en las colonias (biopelículas + células) en comparación con WT solo (8,45E–7 M), pero los contenidos de Fe intracelular no difirió significativamente (Figura complementaria S3a). Además, el mutante ∆yvmC en presencia de Pf-5 acumuló significativamente más Fe en las colonias (3,20E–7 M) en comparación con ∆yvmC (1,58E–7 M), pero significativamente menos que el WT junto a Pf-5 ( Figura 3a). Estos resultados implican que la producción de pulcherrimina favorece la acumulación extracelular de Fe en la biopelícula. Esta observación fue confirmada por un aumento de la acumulación de Fe en MS en la biopelícula WT en presencia de Pf-5, que estimula la producción de PA en el medio MS (Fig. 3b). Solo en MS, la diferencia entre el productor y el no productor de PA no fue significativa tanto en las colonias como intracelularmente (Fig. 3b; Fig. Suplementaria S3b).

a contenido de Fe (en molar; M), normalizado en mg de biopelículas húmedas, de colonias de 48 h formadas en MSgg y (b), en medio MS. c Imágenes de vista inferior de B. subtilis que alberga el indicador transcripcional del gen β-galactosidasa para la producción de DhbA (PdhbA-lacZ) cultivado en MSgg y (d), en medio MS. El contraste de las imágenes se ajustó para permitir una visualización clara. Las actividades de β-galactosidasa de WT y ∆yvmC albergan el indicador PdhbA-lacZ solo y en interacción con Pf-5 en MSgg a las 48 h (f) y en MS a las 24 h. Los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, P <0,05, ANOVA unidireccional y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3. Barra de escala, 5 mm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El mantenimiento de la homeostasis del Fe intracelular (Figura complementaria S3) a pesar de la formación del complejo PA-Fe insoluble sugiere la presencia de una fuerte producción de sideróforos. Para examinar esta hipótesis, se utilizó una cepa de B. subtilis que alberga PdhbA-lacZ, un indicador transcripcional de β-galactosidasa del operón de biosíntesis de DHB y BB. Una colonia cultivada durante 24 h en MSgg mostró un pequeño anillo azul en su centro, y este anillo se oscureció rápidamente con el tiempo, lo que sugiere una limitación de Fe como resultado de la precipitación de Fe (Fig. 3c). Curiosamente, después de 96 h, la señal PdhbA-lacZ también fue visible en el anillo exterior del WT pero no en ∆yvmC (Fig. 3c), lo que probablemente sea el resultado del secuestro de Fe por parte de pulcherrimin como se describe en un estudio anterior14. La expresión de PdhbA-lacZ también se cuantificó a las 48 h en MSgg, donde el WT mostró un mayor nivel de actividad de LacZ en presencia de Pf-5 cuando la PA se produce abundantemente (Fig. 3e). El mutante ∆yvmC mostró una actividad LacZ reducida en comparación con WT, pero se observó un aumento junto a Pf-5, lo que sugiere producción de sideróforos por parte de la colonia competidora (Fig. 3e). En medio MS, donde el EDTA mantiene el Fe en solución, PdhbA-lacZ apareció muy débilmente expresado (Fig. 3d). En presencia de Pf-5, en ambos medios, el WT mostró una coloración azul oscuro (Fig. 3c, d). Se pudo observar un claro gradiente físico de falta de Fe en WT con Pf-5 en medio MS, ya que las células que enfrentaban las colonias Pf-5 tenían un tono mucho más oscuro que el resto de la colonia (Figura complementaria 4a). La expresión de PdhbA-lacZ también se cuantificó a las 24 h en medio MS para confirmar que la expresión de PdhbA-lacZ aumentó solo cuando la PA se produce en gran medida (Fig. 3f). Para validar la contribución de pulcherrimina en la estimulación de la transcripción de dhbA, se utilizó el mutante ∆pchR (el regulador negativo de la síntesis de PA). Como se esperaba, ∆pchR experimentó una grave falta de Fe, como lo demuestra una fuerte expresión de lacZ debajo y encima de la biopelícula (Figuras complementarias 4a-c). Además, incluso si la acumulación de pulcherrimina desencadenara la expresión de dhbA, la presencia de Pf-5 era necesaria para lograr una fuerte expresión de dhbA en toda la biopelícula (Figura complementaria 4b). Estos hallazgos demuestran que una combinación de producción de Pf-5 y pulcherrimina crea un estrés de Fe que provoca una fuerte expresión de PdhbA-lacZ por parte de las células de B. subtilis, lo que sugiere una mayor síntesis de DHB y BB.

El mantenimiento del crecimiento de WT en presencia de Pf-5 en MS, a pesar de que el Fe (III) está quelado en el complejo insoluble de pulcherrimina, plantea dudas sobre cómo B. subtilis adquiere Fe en esas condiciones. Por lo tanto, presentamos un marco conceptual que resume dos posibles formas de recuperación de Fe en presencia de pulcherrimina (Fig. 4a). En primer lugar, el complejo PA-Fe podría ser absorbido por las células de B. subtilis, confirmando su papel como sideróforo como se sugirió anteriormente19. Alternativamente, el fuerte sideróforo BB, que se produce en exceso en estas condiciones, podría removilizar el Fe. De manera similar, Pf-5 podría recuperar Fe de pulcherrimin al poseer la producción de la herramienta adecuada (es decir, el ligando de Fe de alta afinidad pioverdina). Como se ve en la Fig. 4b, la adición de FeCl3 o pulcherrimina restableció el crecimiento de B. subtilis WT (monitoreado como OD600) en comparación con la condición de agotamiento de Fe. La repetición de este experimento con un mutante ∆dhbF, incapaz de catalizar el último paso de la síntesis de BB, demostró un claro defecto de crecimiento en presencia de pulcherrimina como única fuente de Fe, pero no en presencia de FeCl3, de acuerdo con un estudio previo (Fig. 4c)12,24. Finalmente, un mutante ∆dhbA-F, que no puede producir ni DHB ni BB, no pudo crecer en presencia de pulcherrimina y FeCl3, pero pudo crecer en presencia de citrato de Fe (Figura complementaria S5). Este resultado sugiere que la pulcherrimina no es un sideróforo per se y que se requieren sideróforos para la adquisición de Fe unido a pulcherrimina. De manera similar, B. subtilis WT, pero no el mutante ∆dhbF, puede usar pulcherrimina como única fuente de Fe para formar la película rica en Fe (Fig. 4e), un proceso que requiere una gran cantidad de Fe37.

Un marco conceptual en MSgg que muestra la posible ruta de recuperación de Fe. La pulcherrimina podría absorberse como un complejo (sideróforo), o el Fe atrapado en la pulcherrimina podría removilizarse mediante un sideróforo (BB) más fuerte según su constante de afinidad. Una especie extraña (Pf-5) podría extraer el Fe de la pulcherrimina y utilizarlo como fuente de Fe. b, Se monitorizó el crecimiento de B. subtilis WT (mediante absorbancia a OD600) en medio MSgg. La densidad óptica se midió cada 6 h a partir de las 12 h posteriores a la inoculación (12 h, 18 h, 24 h, 30 h y 36 h) en presencia de Fe sin adición (control), FeCl3 50 µM y pulcherrimina 50 µM como Fuentes de Fe. c El crecimiento de ∆dhbF se controló como en (a). d El crecimiento de la cepa competitiva P. protegens Pf-5 se evaluó como en (a). Se realizaron ensayos de formación de películas para evaluar la robustez de la biopelícula en presencia de Fe sin adición, FeCl3 50 µM y pulcherrimina 50 µM como fuentes de Fe. Las películas se cultivaron en una placa de 24 pocillos y se tomaron fotografías 24 h después. Barra de escala (arriba a la derecha: 5 mm). Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Se presentan experimentos e imágenes representativos. Los datos se presentan como valores medios ±SD, n = 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que el secuestro de Fe en pulcherrimin no impide la adquisición de Fe por parte de B. subtilis, podría privar de Pf-5 al monopolizar el Fe (Fig. 4a). Sorprendentemente, Pf-5 todavía mostró un fuerte crecimiento en presencia de pulcherrimina o FeCl3 en comparación con MSgg sin Fe (Fig. 4d), lo que demuestra que el Pf-5 competidor puede utilizar el Fe unido a pulcherrimina.

Para confirmar que BB removilizó el Fe (III) unido a pulcherrimina, se realizó un ensayo de disociación in vitro. Este experimento requiere compuestos purificados de alta calidad, lo que no se puede lograr con los duros pasos del procedimiento de purificación de pulcherrimina. Por lo tanto, se sintetizó la apo-PA para obtener la molécula soluble (consulte los datos complementarios para obtener detalles de la síntesis; consulte la Fig. S6 complementaria para ver las estructuras químicas). La adición de Fe (III) a la apo-PA condujo a la formación de un precipitado rojo escamoso en una proporción de 3: 1 (PA: Fe) (Fig. 5c). Primero, se mezcló pulcherrimina (es decir, Fe-PA) con apo-BB en una proporción de 1:1 según la capacidad de unión de Fe, y se siguió la evolución de la unión de Fe por BB y la resolubilización de PA debido a la disociación a lo largo del tiempo utilizando UPLC-MS. Como se ve en la Fig. 5a, se observó una disminución de apo-BB y un aumento de apo-PA. La apo-PA en ausencia de BB se cuantificó cada 24 h hasta las 96 h y los precipitados de pulcherrimina se pesaron a T = 0 y T + 96 h para evaluar su estabilidad. No se observaron cambios significativos (Figura complementaria S7), lo que confirma que BB disociaba la pulcherrimina uniendo Fe y solubilizando el precursor, PA. El tamaño de los agregados de pulcherrimina también disminuyó con el tiempo y se puede visualizar (Fig. 5c). Paralelamente se pesó el precipitado seco y se observó una disminución en la masa de pulcherrimina, pasando de 3,50 ± 1,11 mg a 1,30 ± 0,26 mg después de 96 h, confirmando la disociación de pulcherrimina por BB (Fig. 5b).

Se mezcló a Apo-BB con pulcherrimina precipitada en una proporción de 1:1. Los aposideróforos (BB y PA) se cuantificaron mediante UPLC-MS y se recolectaron muestras a las 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. n = 12. b Los tubos se centrifugaron y secaron para determinar la masa del precipitado a lo largo del tiempo. n = 12. c Se tomaron imágenes a las 0, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h para visualizar la disociación de pulcherrimina. n = 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

B. subtilis requiere una gran cantidad de Fe para la formación de biopelículas, pero se sabe que la sobrecarga de Fe causa efectos perjudiciales para las células en presencia de oxígeno38. En consecuencia, se necesita una regulación estricta para evitar que el ciclo de reducción-oxidación (redox) y la reacción de Fenton y Fenton se produzcan en estas condiciones. La precipitación de pulcherrimina crea una gran reserva de Fe (III) local, accesible a través de la formación de complejos BB (ver arriba), al tiempo que posiblemente previene la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los niveles de ROS se cuantificaron extracelular e intracelularmente en el WT y el mutante ∆yvmC utilizando la sonda de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina (DCFH2-DA). DCFH2-DA es una sonda fluorescente ampliamente utilizada para la detección de estrés oxidativo general39,40. Como se ve en las figuras 6a, b, las biopelículas WT mostraron niveles bajos de ROS en MSgg, donde la PA se secreta en grandes cantidades, y en el medio MS, donde la producción de PA es mínima. Por el contrario, el mutante ∆yvmC mostró altos niveles de ROS en MSgg pero no en medio MS, lo que indica que la producción de PA y la posterior formación de pulcherrimina son responsables de controlar el estrés oxidativo en MSgg tanto extracelular como intracelularmente (Figuras complementarias S8a-d). La complementación en trans de ∆yvmC redujo los niveles de ROS de manera similar a WT (Fig. 6a, b).

a Cuantificación del estrés oxidativo general (ROS) mediante la sonda DCFH2-DA en medio MSgg. Las intensidades de fluorescencia se normalizaron en la biomasa (OD600). DFO indica que se añadió mesilato de sideróforo deferoxamina para quelar Fe; Com indica la complementación por amyE::PyvmC-yvmC-cypX en el fondo mutante ∆yvmC. Los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. b Igual que en (a), excepto que el experimento se realizó en medio MS. Los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, P <0,05, ANOVA unidireccional y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Las franjas grises indican ausencia de Pf-5 y las franjas blancas indican presencia de Pf-5. c Curvas de perfil de voltametría cíclica de Fe (III) -EDTA (línea negra; la flecha indica el pico de reducción de Fe), Fe (III) -DFO (línea verde azulado; la flecha indica el pico de reducción de Fe, DFO denota deferoxamina) y pulcherrimina ( PA-Fe(III); línea rosa). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Cuando se cultiva en medio MS, el WT produce PA en un nivel alto solo cuando Pf-5 está presente. Además, las células ∆yvmC pero no las WT mostraron altos niveles de ROS en presencia de Pf-5. Estos resultados sugieren que la presencia de Pf-5 crea un ambiente oxidativo que es mitigado por la pulcherrimina. Para confirmar que la PA previene el estrés oxidativo mediante el secuestro de Fe, las biopelículas resuspendidas se complementaron químicamente con deferoxamina (DFO), un conocido agente protector de ROS41 y TPEN (N,N,N',N'-Tetrakis(2-piridilmetilo) etilendiamina), un quelante de metales con alta afinidad por el zinc42,43. Tanto la suplementación con DFO como con TPEN en el mutante ∆yvmC reducen los niveles extracelulares de ROS comparables a los de WT en ambos medios (Fig. 6a, b). Sin embargo, TPEN no redujo las ROS intracelulares a niveles comparables a la suplementación con DFO (Figura complementaria S8c, d), lo que implica que la pulcherrimina, a través de la precipitación de Fe, mitigó el estrés oxidativo en B. subtilis.

Un rasgo distintivo del PA en comparación con la mayoría de los agentes quelantes de Fe es que después de la unión del Fe, precipita el complejo de pulcherrimina resultante. Para explorar la idea de que el secuestro de Fe por pulcherrimina inmoviliza el Fe (III) y previene las reacciones de Fenton, se comparó el potencial redox del Fe unido a PA con dos quelantes de metales conocidos: EDTA y deferoxamina. El complejo preformado Fe-EDTA mostró picos reversibles de oxidación y reducción centrados en E = 83 mV frente a Ag / AgCl (Fig. 6c). Por el contrario, la complejación de Fe por el fuerte quelante deferoxamina (preformado) indujo un gran cambio catódico en el potencial de reducción a −750 mV. Este resultado demuestra que reducir el Fe unido a la deferoxamina es más difícil (Fig. 6c). Para la pulcherrimina en comparación con todos los ligandos, no se ha medido ninguna reacción electroquímica, lo que podría sugerir: (1) que se une al Fe (III) y precipita, lo que conduce a una concentración por debajo de nuestros niveles voltamétricos detectables; o (2) que la pulcherrimina unida a Fe (III) posee un potencial de reducción fuera de la ventana que escaneamos (Fig. 6c; Fig. Suplementaria S9). Sin embargo, ambas hipótesis conducen a una baja reducción de Fe en comparación con otros quelantes de Fe (III), lo que demuestra que la pulcherrimina contrarresta fuertemente el estrés oxidativo.

En ambientes naturales, la adquisición de Fe es de importancia central para que los microbios compitan y protejan sus nichos ecológicos. Es necesario conocer las diversas estrategias y moléculas involucradas en la eliminación y el secuestro de Fe para comprender qué impulsa las interacciones bacterianas en las comunidades naturales. Este estudio proporciona una comprensión sin precedentes de cómo la pulcherrimina, una molécula que precipita Fe de B. subtilis y otros microorganismos, participa en la adquisición de Fe y actúa como agente protector.

Si bien se sugirió que la producción de AP por B. subtilis y Metschnikowia es constitutiva o está modulada por factores abióticos14,44, aquí informamos por primera vez que puede secretarse en respuesta a un competidor específico que hace que el AP forme parte de la caja de herramientas de competencia de B. subtilis. . Las señales que desencadenan la secreción de PA probablemente sean multifactoriales, ya que tanto las moléculas difusibles como los volátiles producidos por Pf-5 desencadenan una alta proporción de células productoras de PA en la población de B. subtilis (Fig. 1). Hay múltiples pruebas de que los volátiles desempeñan un papel importante en la modulación de las comunidades microbianas45,46. En particular, los volátiles de las especies de Pseudomonas son diversos y pueden antagonizar otros microorganismos, incluidos patógenos vegetales fúngicos y bacterianos47,48,49. Podría ser interesante examinar cómo la producción de pulcherrimina afecta la aptitud de B. subtilis en presencia de otras especies bacterianas y, más importante aún, si la pulcherrimina se produce durante la colonización de las raíces de las plantas.

La característica más llamativa del ácido pulcherrimínico es su precipitación tras la unión del Fe(III)15. Si bien se ha propuesto que la pulcherrimina actúe como sideróforo19, nuestro trabajo indica que el complejo PA-Fe no está fácilmente disponible para su absorción y, por lo tanto, no es un sideróforo per se. Sin embargo, nuestros datos también sugieren que podría estar involucrado en una estrategia más amplia para la adquisición de Fe. Una limitación importante de la adquisición asistida por sideróforos es el alto costo de producción de sideróforos y la recuperación del complejo Fe-sideróforo. Además, es probable que la pérdida de sideróforos antes de la recuperación de Fe debido a la difusión fuera de las células y la degradación (por ejemplo, algunos sideróforos son sensibles a la oxidación) aumente el costo de la absorción de Fe. La síntesis de PA es una reacción enzimática de dos pasos que utiliza leucina-ARNt como precursor50, y el BB se produce mediante una síntesis de péptidos no ribosómicos de cuatro pasos12. Por tanto, el coste metabólico del PA es significativamente menor que el del BB. Proponemos que la pulcherrimina podría ser parte de una estrategia de “almacenar y extraer”. Podemos imaginar un modelo en el que se secrete PA (de bajo costo metabólico) para inmovilizar rápidamente el Fe ambiental dentro y en las proximidades de la biopelícula. Esta fuente local inmovilizada de Fe, que no se ve afectada por los flujos potenciales, podría luego ser recuperada por BB (Fig. 4) cuando se necesite Fe.

El secuestro de nutrientes valiosos, intra y extracelularmente, es una estrategia eficaz para gestionar la competencia51,52. El secuestro de Fe (III) en un precipitado sería muy eficaz para frenar el acceso del Fe a los competidores vecinos que carecen de sideróforos fuertes, lo que proporcionaría una ventaja competitiva significativa a B. subtilis. Pero, como se observó con Pf-5 (Fig. 4d), no inhibirá la adquisición de Fe por parte de competidores que poseen sideróforos de alta afinidad. En suelos donde múltiples factores estresantes (por ejemplo, nutrientes) limitan la actividad metabólica, la inmovilización de Fe aún tiene ventajas, si resulta en un impuesto general más alto sobre la adquisición de Fe por parte del competidor que B. subtilis. Por lo tanto, argumentamos que, si bien el secuestro de Fe extracelular por PA probablemente no sea una estrategia única para controlar a los competidores, es otra arma valiosa en el arsenal a disposición de B. subtilis, y potencialmente de otras especies, para controlar el Fe cuando bajo estrés competitivo. Se necesita más investigación sobre la eficiencia del uso de PA-Fe por parte de B. subtilis y sus competidores para probar más esta hipótesis.

Está bien establecido que además de la adquisición de Fe, los sideróforos tienen múltiples funciones fisiológicas que resultan de sus capacidades de quelación de Fe53,54. Además de su papel como inmovilizador de Fe, observamos que la pulcherrimina podría reducir los niveles de estrés oxidativo en la biopelícula de B. subtilis. El estrés oxidativo y el Fe están interconectados mediante la reacción de Fenton, en la que Fe (II) es el sustrato y Fe (III) es el producto. La unión del Fe(III) mediante agentes quelantes, como los sideróforos producidos por diversas especies bacterianas, puede impedir su reducción a Fe(II) y, por tanto, prevenir la reacción de Fenton53,55,56. Al hacerlo, la pulcherrimina limitaría las tasas de mortalidad debido a ROS y permitiría la formación sostenida de biopelículas (Fig. 2), ya que se demostró que B. subtilis necesita controlar estrictamente el nivel de ROS para desarrollar completamente su biopelícula57. Utilizando voltamperometría cíclica, confirmamos que la inmovilización de Fe (III) por pulcherrimina previene su reducción. En particular, el sideróforo débil DHB, producido en altas concentraciones por B. subtilis contra Pf-5, es un compuesto fenólico que puede promover la reacción de Fenton58,59. Por lo tanto, proponemos que la producción de PA y la posterior formación del complejo pulcherrimina contrarresten el efecto de DHB (Fig. 3c, d) y protejan a B. subtilis contra el estrés oxidativo durante la formación de biopelículas, ya que requiere una gran producción de DHB22,24 así como la acumulación de Fe para actividades metabólicas en las capas anóxicas del biofilm24.

La producción de pulcherrimina y sideróforos son rasgos compartidos por muchas especies microbianas, y las estrategias de manejo de Fe descubiertas en este estudio pueden aplicarse a más microbios además de B. subtilis. De hecho, se ha confirmado, mediante análisis comparativo del genoma, que la PA es producida por aislados de Bacillus cereus (patógeno oportunista) y Staphylococcus epidermidis (bacteria comensal de la piel)14. Formar una fuente local inmovilizada pero accesible de Fe controlada por moléculas que precipitan Fe y la producción de sideróforos es una estrategia atractiva para el manejo de Fe a escala de biopelículas (o colonias) y podría estar generalizada en muchos ecosistemas.

Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla S1. Las cepas de B. subtilis se cultivaron de forma rutinaria en caldo lisogénico (Luria-Bertani LB; triptona al 1% p/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, NaCl al 0,5% p/v) a 37 °C en agitación durante 3 h. Las cepas de Pseudomonas se cultivaron en LB a 30 °C en agitación durante 3 h. Cuando fue necesario, se utilizaron antibióticos en las siguientes concentraciones: espectinomicina (100 µg·mL-1), kanamicina (10 µg·mL-1), ampicilina (100 µg·mL-1).

Todos los mutantes de deleción utilizados en este estudio se adquirieron de la colección Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) (//www.bgsc.org) en el entorno de B. subtilis 168 y se introdujeron en las cepas no domesticadas NCIB 3610 mediante transducción utilizando SPP1. -transducción generalizada mediada60. Para los informadores transcripcionales de PyvmC-yfp, la región promotora de yvmC se amplificó mediante PCR a partir de ADNg de NCIB 3610 utilizando los cebadores PBB666 (5ʹ-AGTCGAATTCTGTTCATTAAGGTGCAGCAGTCTCAC-3ʹ) y PBB667 (5ʹ-GTAGCATGCCTATTATGCCCCGTCAAACGCAACG-3ʹ). El fragmento de PCR se digirió usando las enzimas de restricción EcoRI y SphI y se ligó al plásmido pKM00361. El plásmido resultante se linealizó y transformó en B. subtilis 168 antes de introducirlo en NCIB 3610 mediante transducción utilizando fagos SPP1. Para la fusión transcripcional PdhbA-lacZ, la región promotora de dhbA se amplificó mediante PCR a partir de gDNA de NCIB 3610 utilizando los cebadores PBB696 (5ʹ-GCTAGAATTCGTATACGGGCAGAATTTTGCGAGT-3ʹ) y PBB697 (5ʹ-GTACGGATCCTGCGCCTTGACTGGCAAGC-3ʹ). Los cebadores se encargaron a Integrated DNA Technologies, IDT. El fragmento de PCR se digirió usando las enzimas de restricción EcoRI y BamHI y se ligó en el plásmido pDG172862. El plásmido resultante se linealizó y transformó en B. subtilis 168 antes de introducirlo en NCIB 3610, ∆yvmC y ∆pchR mediante transducción utilizando fagos SPP1.

Las cepas de B. subtilis y las especies de Pseudomonas se lavaron en PBS y su DO600 se ajustó a 0,6. Luego se colocaron diez µl de suspensión celular a una distancia de 0,7 cm en Murashige y Skoog (MS; Sigma – M5519; NH4NO3 20,61 mM, H3BO3 100 µM, CaCl2 2,99 mM, CoCl2·6H2O 0,11 µM, CuSO4·5H2O 0,1 µM, 100 µM Na2-EDTA, FeSO4·7H2O 100 µM, MgSO4 1,5 mM, MnSO4·H2O 100 µM, Na2MoO4·2H2O 1,03 µM, KI 5 µM, KNO3 18,79 mM, KH2PO4 1,25 mM, ZnSO4·7H2O 29,91 µM, 26,64 µM M glicina, 0,56 µM mioinositol, ácido nicotínico 4,06 µM, piridoxina·HCl 2,43 µM, tiamina·HCl 0,30 µM, glicerol 0,5% v/v y glutamato 0,5% v/v) o MSgg (fosfato de potasio 5 mM y MOPS 100 mM (3- (ácido N-morfolino)propanosulfónico) a pH 7,0 con MgCl2 2 mM, CaCl2 700 μM, MnCl2 50 μM, FeCl3 50 μM, ZnCl2 1 μM, tiamina 2 μM, glicerol al 0,5 % v/v y glutamato al 0,5 % v/v. ) suplementado con agar al 1,5 % p/v y se incuba a 30 °C. Cuando fue necesario, se añadió X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido) a una concentración final de 120 µg·mL-1. Para evaluar la biomasa y las UFC, se eliminaron las biopelículas de B. subtilis utilizando una punta P200 estéril y se transfirieron a un tubo Eppendorf que contenía 1 ml de PBS. Las biopelículas se sonicaron durante 30 sa 60 s (hasta la homogeneidad) sin pausa con una amplitud del 30%. Las células se diluyeron y se sembraron en LB para el recuento de UFC. La densidad óptica a 600 nm (Biomasa) se evaluó con un espectrofotómetro UV-Vis Genesys 30 S.

Para este estudio se utilizaron dos microscopios. Se utilizó el microscopio estereoscópico Leica M165 FC para tomar imágenes de campo claro en diferentes puntos temporales utilizando la cámara Leica MC170 HD. Para las imágenes de fluorescencia se utilizó la cámara Leica DFC3000 G (escala de grises). El microscopio Zeiss Axio Zoom. También se utilizó el V16 equipado con una cámara en color AxioCam 506. Se utilizó Fiji (ImageJ1; versión 2.9.0/1.53t) para el análisis de imágenes.

Para el análisis de citometría de flujo del reportero amyE::PyvmC-yfp, las células cultivadas durante 24 h se retiraron de la superficie del agar con una punta P200 y se colocaron en un tubo Eppendorf que contenía 1 ml de PBS. Las células se sonicaron con una amplitud del 30% entre 30 y 60 s sin pausa hasta homogeneidad, luego se centrifugaron a 13.800 × g durante 2 min antes de agregar 200 µL de paraformaldehído al 4%. Las células se fijaron durante 7 minutos y se lavaron dos veces con PBS antes del análisis. La recopilación de datos se realizó con BD FACSJazz utilizando un láser de 488 nm y BD Accuri C6 plus. El análisis de los datos se realizó con el software BD (BD CSampler plus versión 1.0.23.1 y BD FACS Sortware 1.2.0.142).

Las biopelículas se pesaron y luego se digirieron usando 0,8 ml de ácido nítrico (grado de metales traza; Fischer Scientific) en un SCP science Digiprep Jr a 65 °C durante 45 minutos. Después de la digestión, se transfirieron 0,4 ml a un tubo Falcon de 15 ml y se llenaron con agua Milli-Q para alcanzar un volumen final de 10 ml. Para la cuantificación del Fe intracelular, las células se aislaron de la matriz a partir de un protocolo optimizado desarrollado en otro lugar22. Las biopelículas totales se recuperaron en 1 ml de oxalato/EDTA (0,1 M/0,05 M) y se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 7 min. Las muestras se centrifugaron a 6500 × g durante 7 min. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de NaCl 0,5 M antes de sonicarse durante 30 segundos con una amplitud del 30%. Se añadió NaOH al sobrenadante a una concentración final de 0,1 M y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 6500 × g durante 7 min y se resuspendieron nuevamente en 1 ml de oxalato/EDTA (0,1 M/0,05 M) durante 7 min. Las muestras se centrifugaron como en los pasos anteriores y los sedimentos se resuspendieron en una solución diluida de oxalato/EDTA (0,025 M/0,0125 M) durante 7 minutos. Finalmente, las células fueron centrifugadas y almacenadas a 4 °C hasta su análisis. Las células se digirieron como se describe anteriormente. Se analizó el contenido de Fe en las muestras en un ICP-MS XSeries 2; Thermo Scientific y en un ICP-MS Agilent 7850 equipado con un muestreador automático SPS 4.

La purificación de pulcherrimina se modificó a partir de protocolos descritos previamente15,19. Brevemente, B. subtilis NCIB 3610 se cultivó a 37 ° C durante 3 h en LB con agitación para alcanzar una DO600 = 1–1,5. Se inoculó un ml de B. subtilis NCIB 3610 (OD600 normalizada a 1) en 50 ml de medio MSgg en un matraz de cultivo de 200 ml sin agitación a 37 °C durante 48 a 72 h (hasta que se vio un precipitado rojo claro). El cultivo se centrifugó a 4 °C durante 15 min a 27.000 x g. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 25 ml de NaOH 2 M para solubilizar el precipitado rojo. La mezcla amarilla se centrifugó a 20.000 x ga 4 ° C para eliminar el hierro precipitado. El sobrenadante transparente se transfirió y se acidificó con HCl al 36,5–38% para alcanzar un pH = 1. Después de añadir HCl, la mezcla empezó a tornarse roja y empezó a aparecer precipitación de pulcherrimina. La mezcla se incubó durante la noche a 4ºC. Luego, la mezcla se centrifugó a 10.000 xg y la pulcherrimina precipitada se lavó con EtOH al 100%. Pulcherrimin se secó a 37 °C durante la noche y se almacenó a 4 °C hasta que se necesitó. Los detalles sobre la síntesis del ácido pulcherrimínico se proporcionan en la información complementaria.

Las biopelículas de B. subtilis se suspendieron en tampón Z (NaHPO4 40 mM; Na2HPO4 60 mM; MgSO4 1 mM; KCl 10 mM) antes de la sonicación con una amplitud del 30% durante 30 segundos y se midió la DO600. Se añadió β-mercaptoetanol hasta una concentración final de 38 mM. Se agregaron veinte microlitros de lisozima (20 mg/mL) a la suspensión bacteriana y se incubaron a 30 °C entre 30 min y 1 h. Todas las muestras se diluyeron y se añadieron 100 µl de una solución de ONPG (4 mg/ml) en tampón z con β-mercaptoetanol (38 mM). Cuando las soluciones comenzaron a volverse amarillas, se agregaron 250 µL de Na2CO3 1 M para detener la reacción y se registraron las DO420 y DO550. Las unidades Miller se calcularon basándose en la siguiente ecuación: Unidades Miller = 1000 x [(A420nm −1,75 x OD550nm)]/(Tmin x VmL x OD600).

Las células de B. subtilis se cultivaron hasta fase exponencial en LB a 37 °C durante 3 h, se lavaron y se resuspendieron en PBS a una DO600 = 1. Luego, se inocularon 15 µl en 1 ml de MSgg en una placa de 24 pocillos. Se agregaron cloruro de hierro (FeCl3) o pulcherrimina o citrato de Fe 12 h después de la inoculación a una concentración final de 50 µM. Para evaluar el crecimiento, se recogió el contenido de los pocillos a las 12 h, 18 h, 24 h, 30 h y 36 h, y se sonicó para romper la película y los agregados. La biomasa se evaluó mediante densidad óptica a OD600, y las células se diluyeron y se sembraron en placas de agar LB para contar las UFC.

Todos los productos químicos utilizados en este trabajo fueron de grado analítico. Se adquirieron metanol (MeOH), agua (H2O) y ácido fórmico (FA) (grado Optima para LC-MS) de Fisher Scientific (Ottawa, ON, Canadá). Las muestras se centrifugaron a 10.000 xg durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se limpió mediante extracción en fase sólida (SPE) utilizando cartuchos HLB (Waters Corporation, Milford, MA). Los cartuchos se condicionaron con 1 ml de MeOH y se equilibraron con 1 ml de H2O. Después de cargar 1 ml de sobrenadante, el cartucho SPE se enjuagó con 1 ml de H2O y se secó durante 1 min utilizando un flujo suave de nitrógeno. El analito se eluyó usando cuatro veces 250 µl de MeOH. Finalmente, la muestra se filtró a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0,22 µm antes del análisis UPLC-MS/MS. Los análisis de las muestras se realizaron mediante cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (UPLC, Xevo TQ MS). Los compuestos se separaron con un HSS-T3 (100 x 2,1 mm, tamaño de partícula de 1,8 µm) (Waters Corporation, Milford, MA). La fase móvil estaba compuesta por el disolvente A (H2O + 0,1% FA) y el disolvente B (MeOH + 0,1% FA). El caudal se ajustó a 0,4 ml/min y el volumen inyectado fue de 3 µl. Después de la inyección, las muestras se eluyeron con el siguiente gradiente: 0-1 min, 5 % B, 1-4 min, 5-100 % B, 4-6 min, 100 % B, 6-7 min, 100-5 % B, 7−8 min, 5% B. La eficiencia del método se muestra en la tabla S2 para la linealidad. Los límites de recuperación, detección y cuantificación se presentan en la tabla S3. Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) se determinaron según el Comité Internacional de Armonización como tres y diez veces el error estándar de la curva de calibración63.

Las colonias de B. subtilis se recogieron después de 24 h y se sonicaron con una amplitud del 30% durante 30-60 s hasta que estuvieron homogéneas. Luego, la suspensión de células se mezcló con diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina (DCFH2-DA; pureza ≥97%, Sigma), un tinte fluorogénico que se convierte en DCF fluorescente, a una concentración final de 100 µM y se incubó en el oscuro durante 1 h. Mesilato de deferoxamina (DFO; pureza ≥92,5%, Sigma) y N,N,N',N'-Tetrakis(2-piridilmetil)etilendiamina (TPEN; pureza ≥97%, EMD Millipore). Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 16.200 xg durante 1 min. Se recogió el sobrenadante (100 µL) y las células se resuspendieron en PBS antes de transferirlas a una placa de 96 pocillos (100 µL), y se midió la intensidad fluorescente con un monocromador TECAN Spark (SparkControl versión 3.1) con un excitador. longitud de onda de 485 nm y longitud de onda de emisión de 535 nm, ancho de banda 20.

Para caracterizar el potencial redox de la pulcherrimina, se realizó voltamperometría cíclica para evaluar en qué medida la pulcherrimina inmoviliza el Fe (III) en comparación con los quelantes de Fe conocidos, como la deferoxamina y el EDTA. Los complejos Fe-Deferoxamina y Fe-EDTA se preformaron durante 1 h en la oscuridad. Para Fe-PA, la complejación se realizó en la celda electroquímica 3 minutos antes de recolectar el primer voltamograma. El experimento se realizó en un CHI-1040C (CH Instruments). Se utilizaron y adquirieron de CH Instruments un electrodo de trabajo de carbón vítreo de 3 mm de diámetro (CHI104), una placa de platino (contraelectrodo) y un Ag/AgCl (KCl saturado; electrodo de referencia). Todos los experimentos voltamétricos se realizaron en PBS desoxigenado con un flujo constante de argón ciclando el potencial entre −1,0 y 1,0 V a una velocidad de escaneo de 25 mV·s−1. Todas las soluciones se evaluaron con 10-4 M de Fe (proporción 1:1; Ligando-Metal) excepto el ácido pulcherrimínico, donde se añadió 2 x 10-4 M (proporción 3:2; PA-Fe).

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 9 versión 9.4.0.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos originales se proporcionan con este documento.

Jolivet, J.-P., Chanéac, C. y Tronc, E. Química del óxido de hierro. Desde clusters moleculares hasta redes sólidas extendidas. Química. Comunitario. 5, 477–483 (2004).

Skaar, EP La batalla por el hierro entre patógenos bacterianos y sus huéspedes vertebrados. PLoS Pathog 6, e1000949 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Andrews, S. C., Robinson, A. K. & Rodríguez-Quiñones, F. Bacterial iron homeostasis. FEMS Microbiol Rev. 27, 215–237 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chandrangsu, P., Rensing, C. y Helmann, JD Homeostasis de metales y resistencia en bacterias. Nat. Rev. Microbiol 15, 338–350 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ratledge, C. & Dover, LG Metabolismo del hierro en bacterias patógenas. Año. Rev. Microbiol 54, 881–941 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Niehus, R., Picot, A., Oliveira, NM, Mitri, S. & Foster, KR La evolución de la producción de sideróforos como rasgo competitivo. Evolución (NY) 71, 1443-1455 (2017).

CAS Google Académico

Miethke, M., Kraushaar, T. y Marahiel, MA La absorción de xenosideróforos en Bacillus subtilis se produce con alta afinidad y mejora la estabilidad del plegamiento de las proteínas de unión al sustrato. FEBS Lett. 587, 206–213 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hibbing, ME, Fuqua, C., Parsek, MR y Peterson, SB Competencia bacteriana: sobrevivir y prosperar en la jungla microbiana. Nat. Rev. Microbiol 8, 15-25 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kramer, J., Özkaya, Ö. & Kümmerli, R. Sideróforos bacterianos en interacciones entre la comunidad y el huésped. Nat. Rev. Microbiol 18, 152-163 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Leinweber, A., Weigert, M. & Kümmerli, R. La bacteria Pseudomonas aeruginosa detecta y responde gradualmente a la competencia interespecífica por el hierro. Evolución (NY) 72, 1515-1528 (2018).

CAS Google Académico

Butaitė, E., Baumgartner, M., Wyder, S. & Kümmerli, R. Las trampas de los sideróforos y la resistencia a las trampas dan forma a la competencia por el hierro en las comunidades de Pseudomonas del suelo y de agua dulce. Nat. Comuna 8, 414 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

May, JJ, Wendrich, TM y Marahiel, MA El operón dhb de Bacillus subtilis codifica la plantilla biosintética para el sideróforo catecólico bacilibactina, éster trimérico de 2,3-dihidroxibenzoato-glicina-treonina. J. Biol. Química. 276, 7209–7217 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, D. y col. Regulación de la síntesis y secreción del ácido pulcherrimínico quelante del hierro ciclodipéptido en Bacillus licheniformis. Aplica. Reinar. Microbiol. 84, e00262–18 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arnaouteli, S. y col. La formación de pulcherrimina controla la detención del crecimiento de la biopelícula de Bacillus subtilis. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. 116, 13553–13562 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kluyver, AJ, Van Der Walt, JP & Van Triet, AJ Pulcherrimin, el pigmento de Candida Pulcherrima. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. EE.UU. 39, 583–593 (1953).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

MacDonald, JC La estructura del ácido pulcherrimínico. Poder. J. química. 41, 165-172 (1963).

Artículo CAS Google Scholar

Melvydas, V., Staneviciene, R., Balynaite, A., Vaiciuniene, J. & Garjonyte, R. Formación de patrones periódicos autoorganizados alrededor de levaduras que secretan un precursor de un pigmento rojo. Res. Microbiol. 193, 87–93 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rychel, K., Sastry, AV y Palsson, BO El aprendizaje automático descubre módulos regulados de forma independiente en el transcriptoma de Bacillus subtilis. Nat. Comunitario. 11, 6338 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krause, DJ y cols. Caracterización funcional y evolutiva de un grupo de genes de metabolitos secundarios en levaduras en ciernes. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. 115, 11030–11035 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oro, L., Ciani, M. y Comitini, F. Actividad antimicrobiana de Metschnikowia pulcherrima en levaduras del vino. J. Aplica. Microbiol. 116, 1209-1217 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mažeika, K. et al. Características de la acumulación de hierro en altas concentraciones en la biomasa de levadura Metschnikowia productora de pulcherrimina. JBIC J. Biol. Química inorgánica. 26, 299–311 (2021).

Artículo de Google Scholar

Rizzi, A., Roy, S., Bellenger, J.-P. & Beauregard, PB La homeostasis del hierro en Bacillus subtilis requiere la producción de sideróforos y la formación de biopelículas. Aplica. Reinar. Microbiol. 85, e02439–18 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rizzi, A. y col. Bacillus subtilis modula su uso de hierro unido a biopelículas en respuesta a la disponibilidad ambiental de hierro. Aplica. Reinar. Microbiol. AEM 86, 00944–20 (2020).

Google Académico

Qin, Y. et al. Heterogeneidad en la transferencia respiratoria de electrones y utilización adaptativa del hierro en una biopelícula bacteriana. Nat. Comuna 10, 3702 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marcus, M. & Marahiel, MA Adquisición de hierro y control de patógenos mediante sideróforos. Microbiol mol. Biol. Rev. 71, 413–451 (2007).

Artículo de Google Scholar

Molina-Santiago, C. et al. La matriz extracelular protege a las colonias de Bacillus subtilis de la invasión de pseudomonas y modula la cocolonización de las plantas. Nat. Comuna 10, 1919 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Powers, MJ, Sanabria-Valentin, E., Bowers, AA y Shank, EA Inhibición de la diferenciación celular en Bacillus subtilis por Pseudomonas protegens. J. Bacteriol 197, 2129–2138 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Howell, CR & Stipanovic, RD Control de Rhizoctonia solani en plántulas de algodón con Pseudomonas fluorescens y con un antibiótico producido por la bacteria. Fitopatología 69, 480–482 (1979).

Artículo CAS Google Scholar

Geels, FP & Schippers, B. Reducción de las depresiones del rendimiento en suelos de cultivo de papa de alta frecuencia después de tratamientos de tubérculos-semilla con antagonistas fluorescentes de Pseudomonas spp. J. Fitopatol. 108, 207–214 (1983).

Artículo de Google Scholar

Berendsen, RL y cols. Descubriendo los genomas de las cepas modelo de Pseudomonas beneficiosas para las plantas WCS358, WCS374 y WCS417. BMC Genomics 16, 539 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhexian, L. y col. Una pantalla de todo el genoma identifica genes en Pseudomonas asociadas a la rizosfera necesarios para evadir las defensas de las plantas. mBio 9, e00433–18 (2022).

Google Académico

Loper, JE, Kobayashi, DY y Paulsen, IT La secuencia genómica de Pseudomonas fluorescens Pf-5: conocimientos sobre el control biológico. Fitopatología 97, 233–238 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu, J. y col. La codependencia metabólica da lugar a oscilaciones colectivas dentro de las biopelículas. Naturaleza 523, 550–554 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonnefond, L. y col. Base estructural para la síntesis de péptidos no ribosómicos mediante un parálogo de aminoacil-ARNt sintetasa. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. 108, 3912 LP–3913917 (2011).

ADS del artículo Google Scholar

Yan, Q. y col. El metabolismo secundario y la competencia interespecífica afectan la acumulación de mutantes espontáneos en el sistema regulador GacS-GacA en Pseudomonas protegens. mBio 9, e01845–17 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kidarsa, TA, Goebel, NC, Zabriskie, TM y Loper, JE Floroglucinol media la comunicación cruzada entre las vías biosintéticas de pioluteorina y 2,4-diacetilfloroglucinol en Pseudomonas fluorescens Pf-5. Mol. Microbiol 81, 395–414 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kolodkin-Gal, I. et al. Control de la respiración de la multicelularidad en Bacillus subtilis mediante un complejo de la cadena del citocromo con una histidina quinasa incluida en la membrana. Desarrollo de genes. 27, 887–899 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Galaris, D., Barbouti, A. y Pantopoulos, K. Homeostasis del hierro y estrés oxidativo: una relación íntima. Acta de Bioquímica y Biofísica (BBA) - Mol. Resolución celular. 1866, 118535 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Reiniers, MJ y cols. Preparación y aplicaciones prácticas de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína en ensayos redox. Anal. Química. 89, 3853–3857 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murphy, MP y cols. Directrices para medir especies reactivas de oxígeno y daño oxidativo en células e in vivo. Nat. Metab. 4, 651–662 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

LeBel, CP, Ischiropoulos, H. & Bondy, SC Evaluación de la sonda 2',7'-diclorofluorescina como indicador de la formación de especies reactivas de oxígeno y estrés oxidativo. Química. Res. Toxico. 5, 227–231 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cho, Y.-E. et al. Agotamiento celular de Zn por quelantes de iones metálicos (TPEN, DTPA y resina chelex) y su aplicación a células osteoblásticas MC3T3-E1. Nutrición. Res. Practica. 1, 29–35 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blindauer, CA, Razi, MT, Parsons, S. & Sadler, PJ Complejos metálicos de N,N,N′,N′-tetrakis(2-piridilmetil)etilendiamina (TPEN): números de coordinación variables y geometrías. Poliedro 25, 513–520 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Horváth, E. et al. El antagonista Metschnikowia andauensis produce enzimas extracelulares y pulcherrimina, cuya producción puede ser favorecida por los factores de cultivo. Ciencia. Rep. 11, 10593 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, K., Lee, S. y Ryu, C.-M. La detección bacteriana interespecífica a través de señales transmitidas por el aire modula la locomoción y la resistencia a los medicamentos. Nat. Comuna 4, 1809 (2013).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Weisskopf, L., Schulz, S. & Garbeva, P. Compuestos orgánicos volátiles microbianos en interacciones dentro del reino y entre reinos. Nat. Rev. Microbiol. 19, 391–404 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Raza, W. et al. Los compuestos orgánicos volátiles producidos por Pseudomonas fluorescens WR-1 restringen los rasgos de crecimiento y virulencia de Ralstonia solanacearum. Res. Microbiol. 192, 103-113 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Prigigallo, MI y cols. Los basidiomicetos son particularmente sensibles a los compuestos bacterianos volátiles: visión mecanicista del estudio de caso de Pseudomonas protegens Volatilome Against Heterobasidion abietinum. Frente Microbiol 12, 684664 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ossowicki, A., Jafra, S. & Garbeva, P. El poder antimicrobiano volátil del aislado rizosférico Pseudomonas donghuensis P482. Más uno 12, e0174362 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Randazzo, P., Aubert-Frambourg, A., Guillot, A. & Auger, S. La proteína similar a MarR PchR (YvmB) regula la expresión de genes implicados en la biosíntesis del ácido pulcherrimínico y en el inicio de la esporulación en Bacillus subtilis. BMC Microbiol 16, 190 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

de Mazancourt, C. & Schwartz, MW Matar de hambre a un competidor: evolución del consumo de lujo como estrategia competitiva. Teor. Ecológico. 5, 37–49 (2012).

Artículo de Google Scholar

Hood, MI y Skaar, EP Inmunidad nutricional: metales de transición en la interfaz patógeno-huésped. Nat. Rev. Microbiol 10, 525–537 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Peralta, DR et al. Enterobactina como parte del repertorio de respuesta al estrés oxidativo. PLoS One 11, e0157799 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Adler, C. y col. Los sideróforos de catecolato protegen a las bacterias de la toxicidad de la piochelina. PLoS One 7, e46754 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Touati, D. Hierro y estrés oxidativo en bacterias. Arco Bioquímico. Biofísica. 373, 1–6 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cornish, AS y Page, WJ Los sideróforos catecolatos de Azotobacter vinelandii: su afinidad por el hierro y su papel en el manejo del estrés por oxígeno. Microbiología (NY) 144, 1747–1754 (1998).

CAS Google Académico

Gozzi, K. et al. Bacillus subtilis utiliza la respuesta al daño del ADN para gestionar el desarrollo multicelular. NPJ Biofilms Microbiomas 3, 8 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, J. & Jordan, RB Cinética y mecanismo de oxidación del ácido 2,3-dihidroxibenzoico por hierro (III). Inorg. Química. 27, 4563–4566 (1988).

Artículo CAS Google Scholar

Lorigooini, Z., Jamshidi-kia, F. & Hosseini, Z. Capítulo 4 - Análisis de ácidos aromáticos (ácidos fenólicos y ácidos hidroxicinámicos). en Avances recientes en el análisis de productos naturales (eds. Sanches Silva, A., Nabavi, SF, Saeedi, M. & Nabavi, SM) 199–219 (Elsevier, 2020).

Yasbin, RE & Young, FE Transducción en Bacillus subtilis por el bacteriófago SPP1. J. Virol 14, 1343-1348 (1974).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sullivan, NL, Marquis, KA y Rudner, DZ El reclutamiento de SMC por ParB-parS organiza la región de origen y promueve la segregación cromosómica eficiente. Celda 137, 697–707 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guérout-Fleury, A.-M., Frandsen, N. & Stragier, P. Plásmidos para la integración ectópica en Bacillus subtilis. Gen 180, 57–61 (1996).

Artículo PubMed Google Scholar

Directrices ICH Q2(R1). Validación de procedimientos analíticos: texto y metodología Q2 (2005).

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Beauregard, el laboratorio Bellenger y el laboratorio Matthew F. Traxler por sus útiles debates. También agradecemos a Daniel Garneau, Philippe Venne, René Gagnon, Matthieu Fillion y Daniel Fortin por su asesoramiento técnico. Agradecemos a François MM Morel y Anne M. Kraepiel-Morel por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca de maestría (302246) de Fond de Recherche—Nature et Technologies para FO, por una beca de doctorado (299933) de Fond de Recherche—Nature et Technologies para VCL, por una beca de descubrimiento de NSERC RGPIN-2016-03660 a JPB y NSERC subvención de descubrimiento RGPIN-2020-07057 a PBB

Estos autores contribuyeron igualmente: Lounès Haroune, Maude Pomerleau, Léo Hall, Frédéric Orban.

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canadá

Vincent Charron-Lamoureux, Maude Pomerleau, Julie Leroux, Jean-Sébastien Bourassa y Pascale B. Beauregard

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canadá

Lounès Haroune, Léo Hall, Frédéric Orban, Adrien Rizzi, Nicolas Fontaine, Élodie V. d'Astous, Philippe Dauphin-Ducharme, Claude Y. Legault y Jean-Philippe Bellenger

Instituto Sherbrooke de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canadá

Lounès Haroune

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VCL concibió el proyecto. PBB y JPB supervisaron el desarrollo del proyecto. Datos adquiridos por VCL, L.Har, MP y JL. JSB asesoró y ayudó en la construcción de las cepas. AR, NF, EVA brindaron asesoramiento técnico. FO y L.Hal realizaron todos los experimentos de síntesis. CYL gestionó y asesoró en química sintética. PDD gestionó y asesoró experimentos de voltamperometría cíclica. VCL, PBB y JPB escribieron el manuscrito y todos los autores contribuyeron con la edición y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Vincent Charron-Lamoureux o Pascale B. Beauregard.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Yunrong Chai y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Charron-Lamoureux, V., Haroune, L., Pomerleau, M. et al. El ácido pulcherrimínico modula la disponibilidad de hierro y protege contra el estrés oxidativo durante las interacciones microbianas. Nat Comuna 14, 2536 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38222-0

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Recibido: 07 de septiembre de 2022

Aceptado: 20 de abril de 2023

Publicado: 03 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38222-0

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