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Evolución de los marcadores genéticos de resistencia a los medicamentos tras la introducción de la dihidroartemisinina.

Feb 27, 2024Feb 27, 2024

Malaria Journal volumen 22, Número de artículo: 231 (2023) Citar este artículo

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La dihidroartemisinina-piperaquina ha sido el tratamiento antipalúdico de primera línea en Indonesia desde 2008. Los estudios anuales de eficacia terapéutica (TES) realizados en los últimos 12 años mostraron una alta eficacia continua del tratamiento en la malaria no complicada por Plasmodium falciparum. Aunque estos estudios no mostraron evidencia de resistencia a la artemisinina, con el tiempo se observó un ligero aumento en el fracaso tardío del tratamiento. Es destacado explorar la evolución de los marcadores genéticos para la resistencia a los medicamentos asociados a ACT desde la adopción de DHA-PPQ.

Se identificaron manchas de sangre seca a partir de una encuesta masiva de sangre de pacientes con malaria falciparum no complicada (N = 50) en Sumba de 2010 a 2018. Análisis del perfil genotípico (N = 51) y un estudio de eficacia terapéutica (TES) de Papúa (N = 142 ) de 2020 a 2021, seguimiento de 42 días. Se utilizó la corrección por PCR utilizando msp1, msp2 y glurp para distinguir el recrudecimiento y la reinfección. El ADN del parásito procedente de DBS se utilizó para genotipificar marcadores moleculares de resistencia a los fármacos antipalúdicos, incluidos Pfk13, pfcrt y pfmdr1, así como la variación del número de copias de genes en pfpm2/3 y pfmdr1.

El estudio reveló la ausencia de SNP asociados con la resistencia al TAR y varios SNP novedosos como L396F, I526V, M579I y N537S (4,25%). En Sumba, el haplotipo mutante SDD de pfmdr1 se encontró en un tercio de los aislados, mientras que en Papúa sólo se encontró el 8,9%. No se observó ninguna de las mutaciones pfcrt relacionadas con la resistencia a la piperaquina, pero el 71% de los aislados tenían pfcrt I356L. La amplificación de los genes pfpm2/3 se produjo en Sumba (17,02%) y Papúa (13,7%), mientras que la prevalencia del número de copias de pfmdr1 fue baja (3,8%) en ambas áreas. Para el estudio TES, se observaron diez recurrencias de infección en los días 28, 35 y 42. Se observó falla parasitológica tardía (LPF) en 10/117 (8,5%) sujetos mediante microscopía. La corrección por PCR reveló que los nueve casos eran reinfecciones y uno se confirmó como recrudecimiento.

Este estudio reveló que DHA-PPQ sigue siendo muy eficaz contra P. falciparum. La arquitectura genética de los aislamientos del parásito P. falciparum durante 2010-2021 reveló que una copia única de Pfpm2 y pfmdr1 eran altamente prevalentes. El ligero aumento en DHA-PPQ LTF alerta a los investigadores a comenzar a probar otros ACT como alternativas a DHA-PPQ para obtener datos de referencia con el fin de tener la oportunidad de lograr los objetivos de eliminación de la malaria para 2030.

En Indonesia, el aumento de las tasas de fracaso del tratamiento de la malaria falciparum no complicada con cloroquina (CQ) y sulfadoxina-pirimetamina (SP) ha provocado un cambio a la terapia combinada basada en artemisinina (ACT) como tratamiento antipalúdico de primera línea desde 2004. 1]. ACT combina un componente de artemisinina (ART) potente pero de acción corta con un fármaco asociado menos potente pero de acción prolongada [2, 3]. El artesunato-amodiaquina (AS-AQ) se introdujo primero, pero los informes sobre la mala tolerabilidad y el aumento de las tasas de fracaso del tratamiento llevaron a cambiarlo a DHA-PPQ en 2008 [4,5,6,7].

Desde 2010, este régimen eficaz y bien tolerado también se ha convertido en el tratamiento de primera línea de otras especies de malaria humana, incluido Plasmodium vivax, debido al aumento de la resistencia a la CQ en esta especie [8]. Los estudios realizados entre 1995 y 2002 en Sumatra del Norte, Kalimantan Occidental, Sulawesi del Norte, Nusa Tenggara Occidental, Nusa Tenggara Oriental y Papúa han demostrado sistemáticamente el fracaso del tratamiento de la CQ en las infecciones por P. vivax. Desde entonces, la CQ no ha sido un tratamiento eficaz para la malaria vivax aguda [9,10,11,12,13,14,15]. Varios estudios han [4, 9, 16] documentado una excelente efectividad y tolerabilidad para el tratamiento con DHA-PPQ de la malaria no complicada en Indonesia, incluso en Papua, Indonesia [17]. Hasta ahora no se ha establecido en Indonesia la resistencia a la artemisinina en Plasmodium falciparum (Fig. 1).

Diagrama de flujo para el estudio del conjunto de muestras.

Los estudios de eficacia terapéutica (TES) realizados entre 2011 y 2018 en Sumatra del Sur, Kalimantan Central, Kalimantan Occidental, Sulawesi del Norte, Sulawesi Central, Maluku del Norte y Nusa Tenggara Oriental han mostrado tasas de curación consistentemente altas en 42 días con DHA-PPQ para el tratamiento. de paludismo falciparum no complicado. No se encontró evidencia de un retraso en la eliminación del parásito, el sello distintivo de la resistencia al TAR [17]. De 2017 a 2018, la vigilancia molecular de K13 en muestras de Papúa Nueva Guinea reveló que todos los aislados de P. falciparum portaban el alelo de tipo salvaje de K13 [18, 19]. También se observaron algunas otras mutaciones, como G453W (20%), V454C (20%), E455K (20%) y T474A (2,6%), en bajas frecuencias [20]. Se ha detectado un mayor número de copias del gen pfpm2/3 en algunos aislados de Papúa que sobrevivieron al DHA-PPQ [5].

Aunque DHA-PPQ siguen siendo eficaces en el tratamiento de pacientes con malaria y no hubo evidencia de fracaso del tratamiento, se deben monitorear periódicamente estudios de evaluación del perfil genotípico y medidas adicionales, como el tiempo de eliminación de parásitos (PCT) y la densidad de parásitos. El intervalo entre la primera dosis del paciente y el momento del primer portaobjetos de sangre negativo se llamó PCT. Según un estudio realizado en Papúa, entre abril de 2017 y abril de 2018, se detectaron parásitos recurrentes de P. falciparum en 7 de 102 casos que completaron el seguimiento de 42 días y se clasificaron como LTF en los días 21, 35 y 42. De los 7 casos de LTF, uno fue reinfectado con P. vivax, 2 se confirmaron como infecciones recrudescentes y los 4 restantes fueron reinfecciones. No se observó ningún retraso en la eliminación del parásito ni reacciones adversas graves en ningún participante del estudio [5].

La eficacia de ACT depende de la sensibilidad de los parásitos a ambos componentes de la combinación. La resistencia a la artemisinina se puede controlar evaluando la tasa de eliminación del parásito y la presencia de SNP en el gen Pfk13, un marcador bien establecido de resistencia al TAR. La resistencia a algunos de los fármacos asociados de ACT se puede controlar mediante vigilancia molecular. Estos incluyen: para PPQ SNP en el gen pfcrt (posición 343, 350, 353) y variaciones en el número de copias (CNV) del gen Plasmepsin2/3 de P. falciparum (pfpm2/3) y el gen pfmdr1. Además para ART SNP en el gen pfcrt (356).

El presente estudio tiene como objetivo evaluar la evolución de los marcadores genéticos de la resistencia a los medicamentos contra la malaria luego de la adopción de DHA-PPQ como medicamento contra la malaria de primera línea en 2010 para cualquier caso de malaria no complicado, las tendencias de la dinámica temporal de la evolución de pfk13. , genes pfcrt, pfmdr1 también un número de copias de pfpm2/3 y pfmdr1 de Sumba y Papúa y observación de PCT, incluida la densidad de parásitos. Este riesgo surge a medida que pueden desarrollarse más parásitos resistentes al PPQ.

El ADN del parásito Plasmodium falciparum a partir de manchas de sangre con papel de filtro se obtuvo de dos estudios de conjuntos de muestras diferentes, como se describe en la Fig. 2. El área seleccionada para los estudios de conjuntos de muestras se basó en el hecho de que ambos sitios tenían una alta incidencia anual de parásitos (API). El API total en Jayapura y Keerom, Papúa, desde 2019 hasta 2021 fue de 95,43 y 383,01, 92,42 y 360,38, 73,08 y 254,93 casos por 1000 habitantes, respectivamente. En West Sumba y Southwest Sumba, el API de East Nusa Tenggara en 2019-2021 mostró 33,22 y 11,95, 33,09 y 24,21, 16,79 y 10,97 casos, respectivamente [21].

Time points history highlights of antimalaria drug resistance in Indonesia along with Southeast Asia. Cited are studies by Wasis and Sandra [65], MoH [66], Hutapea [67], Tjitra et al. [52], Wells [53], Lim et al. [54], Ebisawa and Fukuyama [68], Rumans et al. [69], WHO [51], Cylde et al. [70], Baird et al. [71], Poespoprodjo et al. [72], Yuliani et al. [73], Ratcliff et al. [4], Lederman et al. [74], Sutanto et al. [75], Syafruddin et al. [48], Syafruddin et al. [33], Basuki et al. [76]

Durante el período 2010-2018, se recolectaron de Sumba cincuenta manchas de sangre en papel de filtro (3 MM; Whatman, Hillsboro, OR, EE. UU.) que contenían aproximadamente 25 a 50 μl de equivalente de sangre mediante la detección activa de casos. La selección de la muestra se basó en la disponibilidad de la muestra archivada existente.

Un estudio de eficacia terapéutica realizado en la provincia de Papua de 2020 a 2021 por el Instituto Eijkman de Biología Molecular, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Cibinong, Indonesia, sirve como parte del análisis de DBS para el estudio actual. Los procedimientos de TES siguieron los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Brevemente, se recogieron frotis y transferencias en papel de filtro (Whatman International Ltd., Maidstone, Reino Unido) de pinchazos en los dedos los días antes de la inscripción y luego los días 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35 y 42. Los papeles de filtro con manchas de sangre se dejaron secar por completo, se transfirieron a bolsas de plástico individuales, se etiquetaron y se almacenaron a temperatura ambiente en un desecador de gel de sílice hasta su posterior procesamiento. 2.749 sujetos fueron examinados mediante detección pasiva y activa de casos, y el 42% (1.156/2.749) dieron positivo en malaria. Ciento cuarenta y dos muestras que cumplieron con los criterios de inclusión se obtuvieron de 768, un grupo de individuos infectados con malaria por P. falciparum. Los encuestados tenían edades comprendidas entre 1 y 65 años, pesaban más de 5 kg y tenían fiebre o antecedentes de fiebre en las 24 h anteriores, con malaria confirmada por diapositiva con una parasitemia de ≥ 500/μL de parásitos asexuales para P. falciparum. Mientras tanto, fueron excluidos con los siguientes criterios de exclusión: estar embarazada, tener antecedentes de alergia a los medicamentos del estudio o a sus derivados, haber completado previamente el tratamiento con un medicamento contra la malaria en las 2 semanas anteriores o tener antecedentes médicos de enfermedad no tratada. hipertensión o enfermedades crónicas del corazón, los riñones o el hígado [5]. Todos los participantes del estudio recibieron un tratamiento supervisado de DHA-PPQ desde un centro de salud primaria que contenía 40 mg de DHA y 320 mg de PPQ por tableta y se les administró una vez al día durante tres días, como un régimen de peso por dosis de 2,25 y 18 mg/kg. de DHA-PPQ [26]. Los resultados del tratamiento y una nueva infección se clasificaron según los criterios de la OMS [16, 17, 22].

En este estudio, se seleccionaron cincuenta y una muestras archivadas, que constan de 41 tratamientos exitosos y 10 tratamientos fallidos, de ciento cuarenta y dos sujetos para analizar el perfil genotípico de los marcadores moleculares asociados con el tratamiento de resistencia a DHA-PPQ. Como parte del estudio Papua TES, se evaluó la eficacia clínica y parasitológica de DHA-PPQ en 142 sujetos durante los días 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42 [22].

El ADN de todas las muestras (incluido el conjunto de muestras 2, el día de la inscripción y el día de la recurrencia) se extrajo de las muestras de DBS utilizando un intercambiador de iones Chelex-100 (Biorad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) [22]. El ADN genómico obtenido se purificó siguiendo los procedimientos de Qiagen.

Los polimorfismos en el gen Pfk13 se investigaron mediante amplificación por PCR anidada que cubre la región de la hélice del gen [23], seguida de la secuenciación con un secuenciador ABI (Macrogen Inc, Corea del Sur). Luego, los resultados de la secuenciación se alinearon con el gen Pfk13 de la cepa de referencia 3D7 (PF13 0238) (número de secuencia de referencia NCBI XM 001350122.1). El análisis se realizó utilizando el software BioEdit (Abbott, CA, EE. UU.).

PCR: se amplificó pfcrt a partir de la plantilla de ADN para evaluar las mutaciones de pfcrt relacionadas con la resistencia a PPQ identificadas en un estudio anterior [24, 25]. Estos fueron los codones 343, 350, 353 y 356. En un gel de agarosa al 2%, se visualizaron los productos de la PCR.

Pfmdr1 se amplificó a partir de la plantilla de ADN mediante PCR anidada para evaluar las mutaciones de pfmdr1, incluidos los siguientes SNP: 1034, 1042 y 1246. El amplicón de PCR se analizó en un gel de agarosa al 3% bajo iluminación ultravioleta. Todos los productos de PCR se enviaron para secuenciación de ADN a 1st Base Inc. en Singapur para control de calidad [26, 27]. Los detalles de las secuencias de los cebadores de amplificación y los resultados del producto de PCR están disponibles en el archivo adicional 1: Tabla S1, Fig. S1.

La PCR cuantitativa relativa en tiempo real (PCR en tiempo real TaqMan) en un Applied Biosystems 7500 cuantificó los números de copias de pfpm 2/3 y pfmdr1 (Roche Molecular Systems, Inc., EE. UU.). Cebadores y sondas previamente divulgados [28, 29], se usó un termociclador BioRad CFX 96 para amplificar 20 μL por triplicado. Las estimaciones del número de copias fueron 2 − ∆∆CT, donde CT es la diferencia entre el ciclo umbral (CT) de la muestra desconocida y el CT de la muestra de referencia. Las ejecuciones no son interpretables de valores de Ct > 33 para pfpm2/3 o pftub o muestra con una estimación del número de copias de < 0,5; Las reacciones se repitieron. Como en estudios anteriores, el análisis principal utilizó una estimación del número de copias de corte de 1,5 para distinguir el transporte de los genes pfpm2/3 y pfmdr1 de una sola copia de los de múltiples copias [28, 29].

La especiación de Plasmodium y el genotipo de P. falciparum se determinaron mediante PCR. Los análisis genotípicos de los parásitos en el día 0 y el día de la recurrencia se realizaron utilizando los tres marcadores recomendados por la OMS: genes de proteína de superficie de merozoito 1 (MSP1), MSP2 y proteína rica en glutamato (GLURP) [26, 27]. Los casos se clasificaron como reinfecciones porque los genotipos de los parásitos encontrados el día de la recurrencia diferían de los encontrados el día 0 (pretratamiento). Los genotipos idénticos para los tres marcadores podrían recrudecerse [25, 28].

El análisis se realizó utilizando funciones básicas de Microsoft Office Excel y software de código abierto, RStudio versión 2022.07.2+576, basado en R versión 4.2.2 [30, 31]. Las diferencias significativas en las proporciones de prevalencia de SNP cada año durante el período de estudio se analizaron mediante la prueba exacta de Fischer para variables categóricas o la prueba U de Mann-Whitney para comparaciones no paramétricas. Este estudio utilizó la plantilla de análisis Excel Kaplan-Meier proporcionada por la OMS. Los resultados se expresan como incidencia acumulada de éxito y fracaso, con IC del 95%.

Características demográficas de las muestras de TES, como se muestra en la Tabla 1. Manchas de sangre seca de una encuesta masiva de sangre de pacientes con malaria falciparum no complicada (N = 50) en Sumba de 2010 a 2018 y cincuenta y una de TES de 2020 a 2021 en Papua para analizar la Perfil genotípico de marcadores moleculares asociados con el tratamiento de resistencia a DHA-PPQ. Como parte del estudio Papua TES, se evaluó la eficacia clínica y parasitológica de DHA-PPQ en ciento cuarenta y dos sujetos durante un seguimiento de 42 días (Tabla 2). No se observó ningún fracaso temprano del tratamiento (ETF) en Papua. Sin embargo, diez pacientes de 117 (8,5%) tuvieron una infección recurrente en los días 28, 35 y 42 como fracaso terapéutico tardío (LTF) (Tabla 3).

De las 101 muestras de ADN analizadas, 94 dieron amplicones completos. No se encontró ninguno de los 20 SNP que previamente se había informado que estaban asociados con la resistencia al TAR. Como se muestra en la Fig. 3, la prevalencia general del nuevo alelo mutante no sinónimo en BTB/POZ y el dominio de hélice se encontró en Sumba con un porcentaje de 4/94 (4,25 %, IC 95 % 0,94–1; ver información adicional). archivo 1: Fig. S2, Tabla S2, Tabla 4) en las posiciones L396F, I526V, N537S y M579I.

Mapa de Indonesia que indica el marcador molecular de resistencia y las ubicaciones de muestreo de los aislamientos de campo de P. falciparum durante el estudio de observación. Fuente del mapa de Natural Earth (https://www.naturalearthdata.com) y modificado según los datos de las referencias.

Se midieron con éxito los números de copias de pfplasmepsina 2/3 en 98 muestras. Desde 2010, el Programa Nacional de Control de la Malaria del Ministerio de Salud de la República de Indonesia ha recomendado DHA-PPQ como fármaco de primera línea para la malaria no complicada. Después del despliegue de DHA-PPQ, la prevalencia de parásitos con pfpm2/3 se amplificó lentamente durante 2016-2018 en Sumba (Tabla 4). La amplificación de los genes pfpm2/3 en Sumba y Papúa se encontró en 8/47 (17,02%) y 7/51 (13,7%), respectivamente (Tabla 4). Diez aislados recurrentes de Papua no mostraron amplificación de pfpm2/3 (Tabla 5).

Se midieron con éxito ochenta muestras para determinar el número de copias de pfmdr1, de las cuales 3/80 (3,8%) eran copias múltiples. En Sumba y Papua, los parásitos con amplificación de pfmdr1 tienden a desaparecer después de que AS-AQ fue reemplazado por DHA-PPQ en 2010 (Tabla 4). Este estudio no observó la amplificación concomitante de pfpm2/3 y pfmdr1 (Tabla 5).

Sólo 31 de las 101 muestras fueron amplificadas con éxito por PCR para el gen pfcrt debido a la falta de ADN del parásito. No se observó ninguna de las mutaciones pfcrt relacionadas con la resistencia a la piperaquina. Aunque el número de muestras fue pequeño, aproximadamente el 71 % (22/31) de todos los aislamientos de ambas áreas de estudio tenían pfcrt I356L, como se muestra en la Tabla 4 y en el archivo adicional 1: Tabla S2.

Se amplificaron amplicones de PCR de pfmdr1 a partir de 90 muestras (codones 1034, 1042 y 1246) obtenidas. Tabla 4 y archivo adicional 1: La Tabla S2 muestra que aproximadamente el 79,6% (74/93) de los aislados tenían el haplotipo SND de tipo salvaje. En Sumba, el haplotipo mutante SDD se encontró en un tercio de los aislados (15/48; 31,3%); en Papúa, el haplotipo se encontró en el 8,9% (4/45). En Papua, durante 2 años de observación, la prevalencia disminuyó del 10,3% (3 de 29) al 6,3% (1 de 16) (Tabla 4). Como ambos alelos (1034 y 1246) se observaron en múltiples lugares de Indonesia en toda la región [32, 33], no se encontraron observaciones similares en pfmdr1 (1034C y 1246Y) en ninguno de los aislamientos examinados.

Análisis de ciento cuarenta y dos sujetos infectados por P. falciparum (Tabla 1) 117 casos completaron el seguimiento de 42 días y 25 casos se perdieron durante el seguimiento (LFU) o se retiraron (WTH). La clasificación de los resultados del tratamiento mediante corrección por PCR se presenta en la Tabla 3. En el día 42, se observó ACPR en el 91,5 % (IC 95 %: 84,8–95,8). De los 10 casos de LTF, nueve fueron reinfecciones y uno se confirmó como recrudescente (Tabla 3). Por lo tanto, la eficacia de DHA-PPQ corregida por PCR para falciparum fue del 99,1% (IC del 95%: 94,9-100,0). No se observó ningún retraso en la eliminación del parásito en el día 3 en ningún aislado.

El PCT osciló entre 1,5 y 35,7 días, con una mediana de 1 día (rango intercuartil [RIC], 1 a 2 días) y 38,5 días (RIC, 28 a 42 días) en los grupos ACPR y recurrencia, respectivamente. La dinámica de la densidad de parásitos basada en frecuencias muestra una tendencia decreciente durante las observaciones (archivo adicional 1: Fig. S3), aunque solo una muestra en el último día de observaciones tuvo una parasitemia alta. La media geométrica corregida de las densidades de parásitos (/μL) para las infecciones detectadas fue de 707 326 parásitos/mL (IC del 95%: 469 080 a 1 066 577 parásitos/mL) con una desviación estándar s = 2 891 848 (RIC: 299 600 a 1 525 600) en D0; 29.078 parásitos/mL (IC 95%: 15.665–53.975 parásitos/mL) con desviación estándar s = 55.888 (RIQ: 8.800–106.800) en D1; 3326 parásitos/mL (IC 95% 3095–3,573,239 parásitos/mL) con desviación estándar s = 2715 (RIQ, 1920–5760) en D2; 47.614 parásitos/mL (IC del 95%: 0,12–18 × 1010 parásitos/mL) con desviación estándar s = 80.554 (RIC, 17.280–131.200) en D42 (archivo adicional 1: Fig. S4).

En Indonesia, el AS-AQ se introdujo en 2004 y se informó de una tolerabilidad deficiente. Las crecientes tasas de fracaso del tratamiento de AS-AQ llevaron a un cambio en la política farmacéutica hacia DHA-PPQ en 2008. La resistencia a DHA-PPQ ha surgido en el sudeste asiático, lo que representa una amenaza importante para los esfuerzos de control y eliminación de la malaria [34,35,36]. DHA-PPQ es bien tolerado: un derivado de ART elimina los parásitos más rápidamente y el compuesto activo PPQ elimina los parásitos restantes más lentamente [37]. Las TES realizadas en varias partes de Indonesia [17, 19] revelaron que el DHA-PPQ sigue siendo muy eficaz, como lo demuestra la ausencia de eliminación retardada de los parásitos y los bajos casos de recurrencia de los parásitos después de observaciones de 42 días.

El análisis del gen pfk13 de aislados de P. falciparum recolectados entre 2010 y 2021 reveló la ausencia de mutaciones asociadas con la resistencia al TAR. Sin embargo, se encontraron varios polimorfismos, como L396F, I526V, N537S y M579I. Aunque no están asociados con la resistencia al TAR, estos SNP se han encontrado recientemente y nunca se han descrito en ninguna zona endémica [16, 18,19,20, 23, 24, 34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49,50]. Aún es importante describir con más detalle las funciones de los cuatro SNP. En ningún aislamiento se observó un resultado PCT promedio de 1,5 días y ningún retraso en la eliminación del parásito en el día 3. Los resultados de la TES de Papúa no cumplen con los criterios de la OMS para sospecha de resistencia al TAR [51].

La resistencia a PPQ se ha asociado con el aumento del número de copias del gen pfpm2 [28, 52, 53] y, más recientemente, con alelos mutantes de pfcrt [54,55,56,57,58]. El resultado de esta investigación en 10 casos de infección recurrente no reveló ninguna asociación entre la resistencia a PPQ y el número de copias de pfpm2/3 (Tabla 5). Análisis previos de TES en la región sur de Papúa tampoco identificaron ningún aislado de P. falciparum que portara múltiples copias del gen pfpm2/3 [18]. Otros estudios propusieron mutaciones pfcrt asociadas con la resistencia a PPQ, a saber, 343, 350 o 353 [24, 25]. Esas mutaciones no se observaron en este estudio. Después de la implementación de DHA-PPQ, la prevalencia de parásitos con múltiples copias de pfpm2/3 aumentó lentamente de 2016 a 2018 y parecía ser relativamente prevalente en aislamientos no recurrentes. Todo esto sucedió probablemente debido a la exposición selectiva de DHA-PPQ durante más de 10 años de adopción en Indonesia. El número limitado de muestras utilizadas en este estudio también podría ser un factor determinante, por lo que será necesario realizar más investigaciones para confirmarlo. Aunque no hubo evidencia de un mayor número de copias de pfpm2/3 en los casos de recrudecimiento, el tratamiento con PPQ aún no logró erradicar el parásito de la sangre ni prevenir la reinfección durante el período de seguimiento.

La vigilancia en áreas que dependen del DHA-PPQ como tratamiento antipalúdico de primera línea indicó que la amplificación de pfpm2/3 no era el único factor que generaba resistencia al PPQ. Los antecedentes genéticos de los aislamientos de campo circulantes parecían desempeñar un papel en la susceptibilidad a los medicamentos [36, 37]. También lo apoyan Fidock et al. [42] e Iwanaga et al. [59], que revela específicamente que la producción exitosa de una cepa resistente a los medicamentos se genera directamente en una cepa sensible a los medicamentos mediante un estudio in vitro o una detección funcional de la resistencia a los medicamentos en todo el genoma. Estas transformaciones estuvieron influenciadas por el origen geográfico (Sudeste de Asia, África y América del Sur) y los antecedentes genéticos (alelo haplotipo o genotipo de todos los demás genes relacionados), lo que respalda los resultados de la encuesta poblacional de que el pfcrt mutado posiblemente era suficiente para conferir resistencia [60]. . También se sugirió que la selección inicial de CNV pfpm2/3 y pfmdr1, aunque no surge un fenotipo resistente a PPQ, desarrolló un trasfondo genético para nuevas mutaciones pfcrt [61].

Pfcrt es un gen de 13 exones con varias mutaciones puntuales 74, 75, 76, 220, 271, 326, 356, 371 que se conectan con CQR [42] y 93, 97, 145, 218, 343, 350, 353 asociadas exclusivamente con Resistencia a PPQ [36, 60, 62] ubicada en el cromosoma 7 que abarca un segmento de 36 kb. La región superpuesta se correlacionó con el gen pfcrt y sus elementos reguladores, como el promotor y la región 3' no traducida (3'UTR) responsable de regular y activar la región codificante [59]. Las mutaciones en pfcrt podrían interferir con el transporte de los sustratos naturales fuera de la vacuola digestiva, lo que provocaría un aumento de la presión osmótica. Este fenotipo también se observó en parásitos Dd2 que expresan las mutaciones pfcrt F145I, M343L y G353V [60]. No todas las mutaciones nuevas de pfcrt exhiben un fenotipo DV hinchado, dependiendo de la ubicación de los aminoácidos mutados [63].

Curiosamente, la mutación pfcrt I356T/L también aumentó los valores de ART IC50 y la resistencia [38, 39], lo que enfatiza la reciente correlación de la mutación I356T en el sudeste asiático con poblaciones de parásitos resistentes a ART en la mutación pfk13.[40, 41]. Varias líneas de haplotipos pfcrt de muchas regiones geográficas sirven como antecedentes genéticos, con 356 alelos, ya que uno de ellos se asoció con el desarrollo de resistencia a ART en parásitos P. falciparum [38,39,40, 42]. La presencia de frecuencias moderadas de pfcrt I356L 22/31 (71%) en el sitio del estudio posiblemente se asoció con la presión prolongada del fármaco seleccionado por el tratamiento con DHA-PPQ utilizado y la disponibilidad de acceso a CQ en los sectores de salud privados (no -propósitos de malaria) que podrían facilitar la evolución de los alelos pfcrt de resistencia al ART [16, 39].

Pfmdr1 también se propuso como modulador de la resistencia al PPQ. [28, 34] La resistencia a PPQ también se asoció con la amplificación de pfmdr1. Otro estudio in vitro informó una correlación entre un número de copia única de pfmdr1 y la resistencia de los aislados de P. falciparum a PPQ [35, 36, 43]. Los parásitos Plasmodium falciparum podrían sufrir una desventaja de aptitud o una transmisibilidad reducida si el gen pfmdr1 se amplifica con más frecuencia [47]. Por el contrario, el número de copias múltiples de pfmdr1 se asoció con la resistencia a MQ [29, 37, 44, 64]. Este estudio reveló que los aislados de P. falciparum en Indonesia presentaban predominantemente una copia única de pfmdr1 del 95 %, lo que sugiere una eficacia reducida del PPQ. Estudios anteriores observaron una prevalencia reducida de pfmdr1 multicopia desde que se adoptó DHA-PPQ [28, 37, 45]. Sin embargo, el papel de pfmdr1 sigue siendo controvertido [43, 46].

Además de disminuir las CNV de pfmdr1, el polimorfismo en el gen pfmdr1, como N1042D, aumentó en un 76,9 % antes de la introducción del tratamiento con PPQ. Se observó que el resultado en otra parte oriental de Indonesia, la mutación SNP S1034C alcanzó el 100% en 2010 [49]. Después de la introducción del PPQ, los pfmdr1 S1034C, N1042D y D1246Y disminuyeron significativamente en un 20,4%. Hubo un cambio notable en las frecuencias de haplotipos entre el haplotipo SND y el haplotipo SDD mutante (Tabla 4).

Este estudio reveló que DHA-PPQ sigue siendo muy eficaz contra P. falciparum. La arquitectura genética de los aislamientos del parásito P. falciparum durante 2010-2021 reveló que el número de copias únicas de pfmdr1 y pfpm2/3 era muy prevalente. El ligero aumento en DHA-PPQ LTF alerta a los investigadores sobre la necesidad de probar ACT alternativos para obtener información de referencia en caso de que sea necesario reemplazar DHA-PPQ.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos adicionales.

Plasmodium falciparum

Terapia combinada con artemisinina

Dihidroartemisinina-piperaquina

piperaquina

cloroquina

Sulfadoxina-pirimetamina

artemisinina

lumefantrina

Artesunato-amodiaquina

Plasmodium falciparum cáliz 13

Transportador de resistencia a la cloroquina de Plasmodium falciparum

Resistencia a múltiples fármacos de Plasmodium falciparum 1

Plasmodium falciparum plasmepsina 2/3

Estudio de eficacia terapéutica

Fracaso tardío del tratamiento

Fracaso temprano del tratamiento

Fracaso clínico tardío

Fallo parasitológico tardío

Se perdió el seguimiento

Retiro

Polimorfismo de nucleótido simple

Manchas de sangre seca

encuesta masiva de sangre

Tiempo de eliminación de parásitos

Adecuadas respuestas clínicas y parasitológicas.

Incidencia anual de parásitos

ciclo de umbral

Proteína de superficie de merozoito 1

Proteína de superficie de merozoito 2

Proteína rica en glutamato

Rango intercuartil

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Los autores están profundamente agradecidos al Centro de Investigación de Biología Molecular Eijkman, Agencia Nacional de Investigación e Innovación (BRIN), Cibinong, Indonesia, por todas las instalaciones brindadas, y al Director Coordinador de la Oficina del Programa Global de Malaria de la OMS, Dr. Pascal Ringwald, por su continuo apoyo en Estudios de eficacia terapéutica (TES) en Indonesia. Un agradecimiento especial a Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, Indonesia, por el apoyo de FVR en el programa de estudios de posgrado de la Universidad Mahidol.

HHB y MDGB son miembros del personal de la Organización Mundial de la Salud y son responsables de las opiniones expresadas en esta publicación, que no reflejan necesariamente las decisiones o políticas de la Organización Mundial de la Salud.

En este estudio, la recolección de muestras y los ensayos moleculares contaron con el apoyo del Centro de Investigación de Biología Molecular Eijkman, Agencia Nacional de Investigación e Innovación (BRIN), Cibinong, Indonesia. Las muestras de TES recolectadas en este estudio contaron con el apoyo de la OMS. Varios ensayos fueron financiados por la Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, Indonesia. Este estudio fue apoyado por la Universidad Mahidol, el Fondo de Investigación Estratégica de MU: año fiscal 2023 y parte del Programa de Investigación en Medicina Tropical de Oxford de la Universidad Mahidol financiado por Wellcome Trust del Reino Unido (subvención principal 106698/B/14/Z) y Wellcome Declaración de OA. Esta investigación fue financiada total o parcialmente por Wellcome Trust [220211]. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío.

Programa de Posgrado en Medicina Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad Mahidol, Bangkok, 10400, Tailandia

Farindira Vesti Rahmasari

Departamento de Genética y Medicina Tropical Molecular, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, 420/6 Ratchawithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Tailandia

Farindira Vesti Rahmasari y Mallika Imwong

Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Muhammadiyah Yogyakarta, Bantul, Indonesia

Farindira Vesti Rahmasari

Centro de Investigación Eijkman de Biología Molecular, Agencia Nacional de Investigación e Innovación (BRIN), Cibinong, Indonesia

Puji Budi Setia Asih, Ismail Ekoprayitno Rozi, Suradi Wangsamuda, Rifqi Risandi, Farahana Kresno Dewayanti, Dendi Hadi Permana, Lepa Syahrani y Din Syafruddin

Grupo de Trabajo sobre Malaria, Ministerio de Salud, Yakarta, Indonesia

Helen Dewi Prameswari

Organización Mundial de la Salud, Oficina de País para Indonesia, Yakarta, Indonesia

Herdiana H. Basri

Organización Mundial de la Salud, Oficina de País para Tailandia, Nonthaburi, Tailandia

Maria Dorina G. Bustos

Departamento de Medicina Tropical Clínica, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Tailandia

Prakaykaew Charunwatthana

Unidad de Investigación de Medicina Tropical Mahidol-Oxford, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia

Arjen M. Dondorp y Mallika Imwong

Centro de Medicina Tropical y Salud Global, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Arjen M. Dondorp

Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Hasanuddin, Makassar, Indonesia

Din Syafruddin

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DS, PBSA, PC y MI idearon el estudio para el análisis genético. DS, HHB y MDGB idearon los Estudios de Eficacia Terapéutica (TES) en Indonesia. FVR, PBSA, AD, MI y DS redactaron el borrador original. FVR, PBSA, MI, IER, SW, RR, FKD, DHP, LP y HDP fueron responsables del análisis formal, la investigación, contribuyeron en la curación de datos y la metodología de diseño. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Mallika Imwong.

La revisión ética y las aprobaciones fueron otorgadas por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina, la Universidad de Hasanuddin, Indonesia, el Comité de Ética en Investigación en Salud, la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, Indonesia y la Junta de Revisión Institucional Central de la Universidad Mahidol, la Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol (Aprobación No. MUTM 2012-045-05), Tailandia. Los estudios de eficacia terapéutica (TES) en Indonesia se registraron con el número de ensayo clínico ACTRN12622000248763.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Secuencias de cebadores en este estudio. Figura S1. Resultado del producto de PCR para (A) dominio de hélice K131 (B) pfcrt exón 102 (C) pfmdr13 en gel de electroforesis al 2 %. Figura S2. Cromatogramas de análisis de secuencia sobre la posición de mutación del Kelch13 BTB/POZ y el dominio hélice en Sumba. La flecha muestra la posición de la mutación. Tabla S2. Resumen del intervalo de confianza (IC) del 95% con IC inferior y superior en cada marcador molecular asociado a la farmacorresistencia. Figura S3. Gráfico de líneas que muestra la densidad de parásitos según la frecuencia diaria de observaciones en Papúa. Figura S4. Media geométrica de la densidad de parásitos durante el período de observación de 2020 a 2021 en Papúa.

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Reimpresiones y permisos

Rahmasari, FV, Asih, PBS, Rozi, IE et al. Evolución de los marcadores genéticos de resistencia a los medicamentos después de la introducción de dihidroartemisinina-piperaquina como tratamiento antipalúdico de primera línea para la malaria falciparum no complicada en Indonesia. Malar J 22, 231 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04658-4

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Recibido: 31 de marzo de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 09 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04658-4

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